Preparaat van intact weefsel voor microscopische analyse van de endospermcellaag in zich ontwikkelende en rijpe Arabidopsis-zaden

Een van onze onderzoeksgebieden is seed science. We willen antwoord geven op de vraag hoe endosperm bijdraagt aan het ontkiemen van zaden. Een in vitro test genaamd zaadgroeiremmingstest heeft het fysiologische belang van het endosperm bij het ontkiemen van zaden aangetoond. De Arabidopsis-zaden zijn vrij klein en de locatie van de cellulaire laag van het endosperm bevindt zich onder de testa, de cellen. Het is een uitdaging om endospermmonsters voor te bereiden zonder chemische fixatie. Eerdere analyses van de analyse van het endosperm hebben chemisch gefixeerde monsters gebruikt, zodat ze de beweging van organisme-eiwitten niet konden waarnemen. Ons protocol maakt beeldvorming van de dynamiek van endospermcellen in vijf cellen mogelijk. Ons protocol kan worden uitgevoerd met behulp van standaard laboratoriumapparatuur en biedt een dieper inzicht in de intercellulaire gebeurtenis- en molecuulmechanismen en de reguliere endospermfunctie.

[Verteller] Om te beginnen groeien Arabidopsis-planten op aarde of steenwol tot de bloeifase. Markeer volledig geopende bloemen met gekleurde draden om nul dagen na de bloei aan te geven. Selecteer siliques van 12 tot 16 dagen na de bloei voor de volgende procedure. Knip met een fijne schaar de gemarkeerde ontwikkelende siliques bij de steel af en verzamel ze in buisjes van 1,5 milliliter. Bereid een nat filtreerpapier voor op dissectie om uitdroging te voorkomen en plaats het monster onder een stereomicroscoop. Gebruik twee tangen, een met dikke punten om vast te houden en de andere met scherpe punten om te scheuren. Splits een klep van de replum. Gebruik vervolgens de tang met gesloten punten en pak voorzichtig de ontwikkelende zaden van de siliques op om beschadiging te voorkomen. Bij het gebruik van een injectienaald van 27 gauge maakt u een litteken van ongeveer 0,1 tot 0,2 millimeter groot op de testa en het endosperm rond het embryo. Houd het zaad met een tang vast zonder het te pletten en maak het litteken op de kruising van de zaadlobben en radicaal. Duw nu het embryo naar buiten door in het zaad met een tang te knijpen, zorg ervoor dat de zaadenvelop niet wordt verpletterd en behoud van zijn ronde vorm. Steek de injectienaald in de lege zaadenvelop bij het litteken en prik er van binnenuit in. Houd vervolgens de naald op zijn plaats en gebruik een tang met gesloten punt om het oppervlak van de Testa te krassen. Knip vervolgens een kant van de zaadenvelop af zodat deze open kan gaan. Open nu met een tang met scherpe punt de zaadenvelop tot een vel. Het geïsoleerde monster moet nu een dubbellaagse plaat zijn die is samengesteld uit endosperm en testa. Doe droge Arabidopsis zaden in een tube van 1,5 milliliter en voeg er een milliliter dubbel gedestilleerd water aan toe. Bewaar de zaden minimaal 40 minuten op kamertemperatuur. Bereid een nat filtreerpapier voor op de tafel van de stereomicroscoop voor dissectie en breng met behulp van een micropipet van 1000 microliter de opgenomen zaden over op het natte filtreerpapier. Plaats het monster nu onder een stereomicroscoop. Maak met behulp van een injectienaald een litteken van ongeveer 0,2 millimeter groot op de testa en het endosperm rond het embryo. Houd het zaad met een tang vast zonder het te pletten en richt je op de verbinding tussen het zaadlob en het radicaal voor het litteken. Duw nu het embryo naar buiten nadat u het zaad met een tang hebt geknepen. Vermijd het pletten van de lege zaadenvelop en behoud de ronde vorm. Snijd met een injectienaald zowel de boven- als de onderkant van de lege zaadenvelop af om deze in een cilindrische vorm te vormen. Snijd vervolgens de cilindrische zaadenvelop langs de centrale as om deze in twee stukken te splitsen. De resultaten moeten dubbellaagse vellen zijn, gemaakt van endosperm en testa. Plaats de geïsoleerde endospermmonsters als vellen op een glasplaatje en monteer ze in water. Plaats ten slotte voorzichtig een dekglaasje over het monster en zorg ervoor dat de endospermlaag naar boven wijst in de richting van het dekglaasje. Gebruik nagellak of vet om de randen van het dekglaasje af te dichten en uitdroging te voorkomen voordat u het monster onder een microscoop bekijkt. Talrijke endospermcellen en hun intracellulaire structuren werden met succes gevisualiseerd uit zaden die 14 dagen na de bloei werden geoogst met behulp van het vastgestelde bereidingsprotocol. Fotolichamen werden gedetecteerd in de kern van endospermcellen, die PHYB-GFP tot expressie brachten onder wit licht, wat hun aanwezigheid en nucleaire lokalisatie bevestigt. Endospermcellen vertoonden omkeerbare foto-lichaamsvorming bij afwisselende blootstelling aan verrood en rood licht, wat de omkeerbaarheid van PHYB-foto's en biologische activiteit tot 4,5 uur na dissectie bevestigde. Fluorescerende time-lapse-beeldvorming van mitochondriën in intacte endospermcellen na drie uur zaadremming werd uitgevoerd en mitochondriale beweging werd gedetecteerd. Een meer dynamische mitochondriale motiliteit werd waargenomen in endospermcellen na één dag zaadremming, wat wijst op een toenemende activiteit in de loop van de tijd.