Workflow met behulp van een cryogene samenvallende fluorescentie-, elektronen- en ionenbundelmicroscoop voor het gericht frezen van cellen

Mijn onderzoek ontwikkelt optische microscopiemethoden om cellulaire kenmerken in cryogene lamella te behouden tijdens het freesen van gefocuste ionenbundel, waardoor gedetailleerde analyse mogelijk wordt gemaakt met cryogene elektronentomografie om de inheemse biologische organisatie te onthullen. Optische microscopie is geïntegreerd in CryoFIB-SEM-systemen, maar zelden op dezelfde positie als de FIB. Dit vereist registratiegerichte richtlijnen om fluorescerend gelabelde doelen in de uiteindelijke lamella te behouden.

Om te beginnen koelt u het transferstation handmatig met vloeibare stikstof zodra de trap cryogene temperaturen heeft bereikt. Laad een geclipte autogrid in de monstercassette die is ontworpen voor het cryogene lichtmicroscopiesysteem. Zorg ervoor dat het autogrid tussen de gelijmde deksel en de afstandhouder is geplaatst.

Draai de ringschroef vast om de cassette te sluiten en steek hem in de gleuf van het transferstation. Verbind het transferstation aan het cryogene lichtmicroscopiesysteem. Gebruik de camera van de interne kamer om de samplecassette naar het samplestadium te leiden.

In de lichtmicroscopiesoftware verplaats je de monstertrap van de laadpositie naar de vooraf gedefinieerde driebundelpositie. In de FIB-SEM-software zet je de vergroting op 100X en klik je op het linkerbovenvenster. Klik in het uitlijningstabblad van de lichtmicroscopiesoftware op Z en selecteer de Play-functie om een SEM-atlas van het raster te verkrijgen.

Identificeer een vierkant gebied met gebroken koolstoffilm en klik er dubbel op om de monsterfase naar die locatie te verplaatsen. Keer terug naar de software-interface. Activeer de FIB en maak een afbeelding.

Pas de vergroting aan via het dropdownmenu linksboven. Druk op Afspelen om de FIB-afbeelding weer te geven. Stel vervolgens de stapgrootte in met de schuifbalk.

Klik nu op Z en Z om de positie van fase Z aan te passen totdat de horizontale lijn in het ion en de elektronenbeelden uitgelijnd zijn met hetzelfde element. Selecteer het tabblad SEM in de lichte microscopiesoftware. Gebruik de X- en Y-knoppen om een gemeenschappelijke eigenschap tussen de SEM- en ion-afbeeldingen uit te lijnen.

Zet nu de fluorescentiemicroscoop aan. Selecteer het tabblad FLM, stel de beeldomstandigheden voor gereflecteerd licht in en selecteer Play. Lijn vervolgens het gereflecteerde lichtbeeld uit met het SEM-beeld.

Zoom in op de afbeelding en klik op de rechthoekoptie om een freespatroon voor de ionenbundel te definiëren. Druk op Start Patterning in Display 2 om een klein patroon te freezen met de gefocuste ionenbundel. Bevestig dat het gefreesde patroon zichtbaar is in zowel de gefocuste ionenbundel als de fluorescentiemicroscoop.

In de lichtmicroscopiesoftware ga je naar het tabblad Lokalisatie en activeer je de juiste voorwaarden om de fluorescentiekanalen in te stellen. Wijs elke fluorofoor toe aan een apart kanaal en voeg een extra kanaal toe voor brightfield. Pas het LED-vermogen en de belichtingstijd voor elk fluorescentiel kanaal aan om het doelwit van interesse te identificeren.

Zodra de parameters bevredigend zijn, verkrijg je een voorfreesende fluorescerende z-stack door door de axiale richting te stappen. Markeer vervolgens het doelwit als een interessegebied. Schakel over op de FIB-SEM-software en teken een lamella in het interessegebied.

Voer ruwe frees uit om het bulkmateriaal te verwijderen terwijl de fluorescentiemicroscoop aan blijft staan om signaalveranderingen te monitoren. Open de op Python gebaseerde interferometrische toolkit vanaf de terminal om het fluorescerende signaal tijdens lamellaverdunning te monitoren. Verdun de ROI tot ongeveer twee micrometer met behulp van de reinigingsdwarsdoorsnedemodus.

Voor een doel met een axiale omvang van meer dan 300 nanometer selecteert u in de Python GUI het doel in de fluorescentiemicrografie. De software begint automatisch de helderheid te plotten als functie van de tijd bij elk nieuw frame. Monitor de fluorescentieintensiteit via de Python-toolkit.

Fres het monster met reinigingsdwarsdoorsnedemodus om eventuele resterende steunfilm onder het interessegebied te verwijderen. Let op plotselinge dalingen in fluorescentieintensiteit als aanwijzingen om van freesrichting te veranderen. Als er een scherpe daling wordt waargenomen bij het frezen van onder naar boven, stop dan en begin met frezen van bovenaf.

Na het voltooien van het bovenaf frezen wordt de lamella afgerond door van onderaf naar boven te frezen in de reinigingsdwarsdoorsnedemodus totdat de gewenste dikte is bereikt. Maak vervolgens een fluorescentiebeeld van de lamel na het frezen. Breng het monster over naar een CryoTEM.

Laad de post-frees multikanaals fluorescentieafbeelding en de CryoTEM-projectieafbeelding in de aangepaste projectieve transformatiesoftware voor registratie van interessegebieden. Selecteer nu acht tot tien paren referentiepunten die zichtbaar zijn in zowel fluorescentie- als elektronenmicroscopiebeelden om projectieve transformatie te berekenen. Gebruik de overliggende afbeelding als leidraad om een beeldgebied te selecteren.

Selecteer vervolgens de juiste vergrotings- en acquisitieparameters voor de kantelserie, afhankelijk van de grootte van de doelstructuur en de gewenste resolutie. Gedifferentieerde macrofagencellen gelabeld met SiR-Tubuline vertoonden één helder fluorescerende punt, ongeveer één micrometer in diameter, overeenkomend met de MTOC, samen met fibro-achtige structuren die naar de celperiferie uitstraalden, consistent met het microtubuli-netwerk. Terwijl het monster werd gemalen tot ongeveer 800 nanometer dikte, werd de enkele fluorescerende MTOC-punctum uiteengezet in twee afzonderlijke speckles, elk ongeveer 700 nanometer in diameter.

De fluorescentieintensiteit nam toe na verwijdering van niet-fluorescerend bulkmateriaal en de absorberende ondersteuningsfilm, gevolgd door een scherpe afname toen de lamella verder werd verdund van twee micrometer tot onder de 200 nanometer. Gecorreleerde cryogene fluorescentie en elektronenmicroscopie maakten nauwkeurige targeting van structuren tijdens het malen mogelijk. Gereconstrueerde tomogrammen en gesegmenteerde modellen tonen aan dat de centriolen bestaan uit microtubuli-triplets.

In gevallen waarin slechts één fluorescerende vlek in de laatste lamella was behouden, werd een enkele centriool zichtbaar in het bijbehorende tomogram. De nauwkeurigheid van fluorescentie op basis van millimilling wordt beperkt door registratiemethoden, die veel lijden onder diffractiebeperkte resolutie, brekingsindexmismatch en ook door freesen veroorzaakte beweging. Gelijktijdige optische microscopie en FIB-freesen verwijderen registratiefouten door in plaats daarvan realtime feedback van fluorescentiemicroscopie te gebruiken om het freesproces te sturen.

Dit voorkomt fouten door de diffractielimiet en de brekingsindexmismatch, waardoor nauwkeurig frezen mogelijk wordt gemaakt dat fluorescentie-gelabelde structuren voor cryo-elektrontomografie binnen de uiteindelijke lamella behoudt. Ons onderzoek maakt het mogelijk om cellulaire structuren te zien die voorheen moeilijk direct te visualiseren waren door cryoET, waardoor licht wordt gelegd op moleculaire mechanismen achter een breed spectrum van belangrijke micromoleculaire machines.