Muismodel van metabole disfunctie-geassocieerde steatotische leverziekte met fibrose

In ons onderzoek richten we ons op metabole disfunctie-geassocieerde steatotische leverziekte, of MASLD, en specifiek op de mechanismen van lipidenophoping en fibrose. Enkele recente ontwikkelingen zijn single cell en speciale transcriptomics, de standaardisatie van diermodellen van MASLD, en de goedkeuring van semaglutide voor de behandeling van MASLD. Er zijn veel diermodellen van MASLD, maar we ontdekten dat veel daarvan geen leverfibrose induceerden.

Om dat punt aan te pakken, hebben we ons muismodel van MASLD ontwikkeld. Ons muismodel induceert MASLD met fibrose door hyperfagische muizen een dieet te geven dat vergelijkbaar is met het gemiddelde Amerikaanse dieet. Dit veroorzaakt MASLD die sterk lijkt op de ziekte bij mensen.

Onze methode zal studies naar de pathofysiologie van MASLD en het testen van nieuwe therapieën faciliteren. Om te beginnen maakt u een leverweefselsectie met paraffine op een preparat. Voor deparaffinisatie dompel je de glaasglaas vijf tot vijftien minuten onder in xyleen of citrisolv.

Daarna rehydrateer je de sectie serieus in 100, 95 en 70% ethanol, gevolgd door gedestilleerd water gedurende vijf minuten in elk. Daarna vlek je het gedeelte met Sirius Red en droog de dia. Haal één diaapje tegelijk uit de reinigingsoplossing en dep het op een papieren handdoek om overtollig vocht te verwijderen.

Voeg ongeveer 50 tot 100 microliter montagemateriaal toe aan het gedeelte. Bedek het gedeelte met een deksel en druk het voorzichtig naar beneden om luchtbellen te verwijderen. Laat de glijbaan aan de lucht drogen.

Bekijk nu het voorbereide gedeelte onder een lichtmicroscoop met helderveldverlichting met 4x tot 20x objectieven. Breng ongeveer 500 tot 1000 microliter leverhomogenaat over in centrifugebuizen van 1,5 milliliter en voeg tricloorazijnzuur toe om een uiteindelijke concentratie van 12% te bereiken; vortex de buis kort om de inhoud te mengen. Incubeer de buis 30 minuten in een ijswaterbad en centrifugeer hem op 6.000 g bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten.

Verwijder daarna het supernatant met een pipet. Voeg één milliliter 100% ijskoude ethanol toe om de pellet te wassen en sonicaat hem zodat hij grondig opnieuw kan ophangen. Na het opnieuw centrifugeren van de suspensie, aspireer je het supernatant.

Na de derde wasbeurt houd je de tube open om de pellet 10 minuten of langer aan de lucht te laten drogen indien nodig. Voeg vervolgens 800 microliter van 6 normale zoutzuur toe aan de buis met de eiwitpellet, en suspendeer de pellet opnieuw met een sonicator zoals eerder gedemonstreerd. Breng de suspensie over in een glazen buis of flesje met schroefdeksel en sluit de dop stevig af.

Incubeer de buis ongeveer 22 uur in een oven op 110 graden Celsius. Indien nodig, breng de inhoud van het glazen flesje over in een centrifugebuis voordat je het laat draaien. Centrifugeer het gehydrolyseerde monster op 16.000 g gedurende 10 minuten en aspireer het supernatant met hydroxyproline in een buis van 1,5 milliliter.

Voor hydroxyprolineoxidatie voeg je 450 microliter chloramine-oplossing toe aan buizen met 50 microliter monster en standaarden. Meng de inhoud in de buisjes met een vortex en bebroei ze 25 minuten op kamertemperatuur. Voeg vervolgens 500 microliter Ehrlich's reagens toe aan elk monster en standaard.

Na het vortexen incubeer je de monsters bij 65 graden Celsius gedurende 20 minuten in een broedmachine. Laat de buizen na de incubatie afkoelen tot kamertemperatuur en observeer de uiteindelijke kleur van de monsters. Meet tenslotte de absorptie van monsters en standaarden met een spectrofotometer bij een golflengte van 550 nanometer.

Collageenkleuring van leverweefsel met Picro Sirius Red, waargenomen met helder veldverlichting, toonde collageenrood met een lichtoranje of gele achtergrond. Collageenafzetting die overeenkomt met fibrose werd gekleurd, evenals collageen in de bloedvatwanden, het hilum en de levercapsule. De gepolariseerde lichtmicroscopie toonde duidelijke dubbelbrekende collageenvezels op een donkere achtergrond, wat de visualisatie van fibrose verbeterde.

Kwantificering van levercollageenpositief gebied bij agouti gele muizen die werden gevoed met een dieet met hoog vet en fructose, of HFFD, toonde significant een hogere fibrose in vergelijking met de wildtype-controlemuizen die een vetarm en fructosedieet kregen. Kwantificering van het leverhydroxyprolinegehalte toonde een significant hoger niveau aan bij agouti gele muizen die HFFD-voeding kregen dan bij de controlemuizen na 16 weken op het dieet, wat een verhoogde collageenafzetting in fibrotische levers bevestigde.