Onderzoek naar de sequentiële cellulaire gebeurtenissen van fagocytose veroorzaakt door Godanti Bhasma in zoogdiercellen

Fagocytose, waarbij een fagocyt vreemde deeltjes opneemt en afbreekt. Het is cruciaal voor de immuunafweer. Er zijn verbeterde gebruiksvriendelijke methoden nodig om dit complexe cellulaire proces efficiënt te monitoren en te evalueren.

Het vastleggen van real-time degradatiegebeurtenissen en het vermijden van artefacten van fotoverbleking blijven belangrijke uitdagingen bij het nauwkeurig bestuderen van fagocytose en intracellulair verkeer. In tegenstelling tot fluorescerende of synthetische deeltjes, maakt ons protocol gebruik van Godanti Bhasma, een labelvrij deeltje dat directe visualisatie van fagocytosestadia mogelijk maakt zonder fotobleken, optimalisatie of complexe voorbereiding. Deze bevindingen bieden een reproduceerbaar model om fagocytische mechanismen te ontleden en bieden nieuwe hulpmiddelen om vesiculaire dynamiek, disfunctie van pathogenen en mogelijke therapeutische interventie voor immuun- en lysosomale aandoeningen te bestuderen.

We streven ernaar de moleculaire regulatoren van fagosoom van rijping te onderzoeken, fagocytische disfunctie in ziektemodellen te onderzoeken en potentiële geneesmiddelen te screenen die vesiculaire dynamiek en intracellulair verkeer moduleren. Weeg om te beginnen precies 100 milligram Godanti Bhasma of GB-poeder af. Suspendeer het poeder in 10 milliliter DMEM aangevuld met 10%FBS en 1%penicilline streptomycine.

Draai de suspensie grondig om de inhoud te mengen en laat het mengsel een minuut staan om de grotere deeltjes op de bodem te laten bezinken. Breng met behulp van een pipet de bovenste vijf milliliter van de suspensie over in een steriele centrifugebuis. Label de vijf milliliter overgedragen GB-suspensie als de standaardoplossing voor verder celkweekwerk.

Draai de suspensie opnieuw grondig om een gelijkmatige verspreiding van de deeltjes te garanderen voordat u deze aan de cellen toevoegt. Zaai 3 10 tot de vierde macht 3T3-L1 cellen in een schaaltje van 35 millimeter met twee milliliter DMEM. Incubeer de schaal bij 37 graden Celsius in een atmosfeer van 5% koolstofdioxide totdat de cellen 70% samenvloeiing bereiken.

Meng vervolgens 300 microliter van de GB stock suspensie grondig door twee milliliter voorverwarmd vers kweekmedium. Plaats de kweekschaal met cellen en GB-suspensie op de podiumincubator van de beeldmicroscoop. Selecteer het 10x objectief op de microscoop.

Schakel de heldere veldverlichting in met de knop Helder. Start vervolgens de DIGI ImagePlus-software en selecteer de juiste camera. Klik op de Vastleggen knop en kies de time-lapse optie.

Stel de intervaltijd in op vijf minuten en begin met opnemen door op de knop Voltooien te klikken. Leg heldere veldbeelden vast met tussenpozen van vijf minuten gedurende 16 tot 24 uur in de kooldioxide-incubator van de microscoopfase. Gebruik ImageJ-software om alle vastgelegde afbeeldingen samen te voegen tot een time-lapse-video.

Dit maakt het mogelijk om de fagocytosestadia te identificeren, van de internalisatie van de deeltjes tot hun volledige afbraak. Na 24 uur celgroei in platen met 96 putjes, mengt u de GB-deeltjessuspensie grondig. Voeg 30 microliter van de suspensie toe aan elk putje.

Gebruik putjes zonder GB-deeltjes als negatieve controles. Incubeer de platen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide om vacuolevorming te induceren. Om een neutrale rode oplossing te bereiden, lost u neutraal rood op om een oplossing van 0,5 milligram per milliliter te maken in serumvrije DMEM.

Filtreer de oplossing door een filter van 0,2 micrometer. Verwijder voor beeldvorming de media van platen met 96 putjes. Nadat je 60 microliter van de filterkleurstof aan elk putje hebt toegevoegd, incubeer je de plaat gedurende 37 minuten op 15 graden Celsius.

Was de putjes drie keer met PBS om overtollige kleurstof te verwijderen. Ga dan verder met microscopische beeldvorming. Onderzoek de gekleurde vacuolen onder een microscoop met behulp van het 20x-objectief om de grootte, morfologie en het aantal vacuolen te beoordelen.

Om bafilomycine A1-stockoplossing te bereiden, lost u 100 microgram van de verbinding op in 50 microliter dimethylsulfoxide. Verdun het vervolgens met 950 microliter DMEM. Verdun voor de werkoplossing één microliter van de bouillon in 1,6 milliliter DMEM om een uiteindelijke concentratie van 0,1 nanomolair te verkrijgen.

Meng de werkoplossing grondig en voeg 100 microliter toe aan de putjes met cellen in de platen met 96 putjes. Incubeer vervolgens de cellen in elk putje met 30 microliter GB-deeltjessuspensie om de remming van de vorming van vacuole en fagosoom te bestuderen. Om de verzuring van fagosomen te remmen, voegt u 100 microliter van de bafilomycine A1-werkoplossing toe aan putjes met voorgevormde vacuolen die eerder met GB zijn behandeld. Incubeer alle putjes bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide gedurende 24 uur.

Voeg 60 microliter neutrale rode kleurstof toe aan elk putje. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius en was de putjes drie keer met PBS om overtollige kleurstof te verwijderen, en analyseer vervolgens de vorming en verzuring van vacuoles onder de microscoop. Behandel de gekweekte cellen met 50 microliter GB-suspensie en incubeer ze een nacht bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide onder standaard experimentele omstandigheden.

Voeg na de behandeling acridine-sinaasappeloplossing in een concentratie van één milligram per milliliter toe aan de cellen en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius om vacuolen en zure vesiculaire organellen te kleuren. Was de cellen vervolgens drie keer met steriel PBS om eventuele ongebonden kleurstof te verwijderen en achtergrondfluorescentie te verminderen. Analyseer ten slotte de gekleurde objectglaasjes onmiddellijk met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een 20x objectief en een blauw excitatiefilterbereik van 450 tot 492 nanometer.

Beoordeel de cellulaire morfologie en de opname van acridine-sinaasappel om de vacuolaire dynamiek te begrijpen. Na 30 minuten GB-behandeling werden deeltjes waargenomen die zich vasthechtten aan het oppervlak van drie 3T3-L1-cellen. Er verscheen een bekerachtige membraanverlenging rond het deeltje dat de initiatie van deeltjesverzwelging aangaf.

12 uur na de behandeling werden grote membraangebonden vacuolen met GB-deeltjes in de cellen waargenomen. Time-lapse-beeldvorming toonde de stapsgewijze internalisatie en vacuolevorming in een enkele levende cel gedurende 4,75 uur. GB-deeltjes in vacuolen degradeerden in de loop van de tijd geleidelijk en de cel kreeg weer een normale morfologie, zoals aangegeven door de vacuolaire omzet.

Flowcytometrie-analyse toonde aan dat geïnternaliseerde Godanti Bhasma-deeltjes binnen 24 uur volledig werden afgebroken zonder dat er deeltjes in het kweekmedium achterbleven. Neutrale rode kleuring toonde een significant hogere vacuoleverzuring in met GB behandelde cellen van alle drie de cellijnen in vergelijking met controles die slechts zwakke lysosomale kleuring vertoonden. Acridine oranje kleuring vertoonde oranjerode fluorescentie in vacuolen van GB 3T3-L1-cellen, wat wijst op verzuring, terwijl onbehandelde cellen alleen groene fluorescentie vertoonden.

Gelijktijdige behandeling met bafilomycine remde de vorming van vacuole in zowel 3T3-L1- als HeLa-cellen, zoals blijkt uit de afwezigheid van vacuolen in vergelijking met hun respectievelijke controles. Na behandeling met bafilomycine werd de neutrale roodopname effectief geblokkeerd, waardoor de verzuring en rijping van vacuolen in cellen werden verstoord.