Een brouwpijplijn voor het genereren van moleculaire operationele taxonomische eenheden (MOTU's) tussen oever- en waterkevers

Dit protocol probeert de ontdekking van soorten in de MEGA-tropen te versnellen en heeft tot doel een hypothese van soortenclustering te genereren in water- en oeverkevers met behulp van een brouwsel van computergebaseerde analyse.

Deze brouwpijplijn, die gebruik maakte van COI-DNA-sequentie, heeft geleid tot meer bewijs voor een soortafbakening voor gerafte kevers van het geslacht Anisostena, die eerder alleen is opgericht met behulp van morfologische gegevens.

Dit protocol probeert de taxonomische belemmering aan te pakken dat het ontdekken van soorten door middel van op morfologie gebaseerde taxonomie, die wordt beschouwd als de gouden standaard in de systematiek van insecten, vaak tijdrovend en verwarrend is voor onderbestudeerde, maar MEGA diverse en zeer onopvallende waterkevers.

[Emmanuel] Deze pijplijn genereert moleculaire accessoire hypothesen, MOTU's genaamd, ongeacht of de sequentie overeenkomt met de bekende soorten per gerefereerde sequenties, of dat de soorten onontdekt of onbeschreven zijn.

Hiermee, in plaats van honderden genitale structuren van kevers in één keer te ontleden en te vergelijken, biedt de pijplijn een voorlopige clustering waarop exemplaren kunnen worden onderzocht op conspecificiteit.

[Verteller] Start om te beginnen MEGA X en laad de DNA-sequenties voor uitlijning. Open de uitlijningsinterface door een lijn te selecteren, vervolgens op uitlijning bewerken of opbouwen te klikken en een nieuwe uitlijning maken te kiezen. Klik op OK om de selectie te bevestigen en selecteer DNA als gegevenstype. Beweeg de muis over het tabblad Bewerken. Klik op volgorde uit bestand invoegen. Navigeer naar de juiste map en selecteer de sequentiebestanden die u in MEGA wilt laden. Klik nu op uitlijning en selecteer vervolgens uitlijnen door ClustalW om de sequenties uit te lijnen met behulp van standaardinstellingen en klik op OK om verder te gaan. Voor het handmatig bewerken van de sequenties verwijdert u alle invoegingen door op de ingevoegde voetstukken of posities te klikken en op de delete-toets op het toetsenbord te drukken. Corrigeer vervolgens verwijderingen door op het streepje te klikken dat een ontbrekende basis vertegenwoordigt, deze te verwijderen en de beoogde basis te typen. Zoek vervolgens de vroegste positie waar alle sequenties een teken bevatten. Klik op het lege vak in de kop van de rij direct links van deze positie en sleep om alle overtollige startposities te selecteren. Druk op delete om ze bij te snijden. Zoek vervolgens de laatst uitgelijnde positie en klik op het vak rechts van dit punt. Druk nogmaals op delete om het einde bij te snijden. Selecteer nu alle sequenties en klik op het tabblad Vertaalde eiwitsequenties. Controleer desgevraagd de genetische code als mitochondriaal van ongewervelde dieren. Als de genetische code anders is, klikt u op nee en verschijnt er een menu waarmee men het vakje voor ongewervelde mitochondriale genetische code kan aanvinken. Als stopcodons met een sterretje in de uitlijning in een hele kolom voorkomen, klikt u op DNA-sequenties en verwijdert u de eerste positie voor alle sequenties. Klik opnieuw op DNA-sequenties en sla de uitlijning op in .mos- of .mosx-indeling. Om de afbakening te starten met behulp van de TaxonDNA-module, opent u de TaxonDNA-software. Klik op importeren, selecteer vervolgens FASTA en upload het uitlijningsbestand in FASTA-formaat. Klik nu op modules en selecteer vervolgens cluster. Stel de drempelwaarde in op 3% en vink het vakje met het label Genereer individuele informatie voor elk cluster aan. Klik op nu clusters maken om te beginnen met clusteren en de resultaten op te slaan door een screenshot te maken. Voor afbakening met behulp van de Kimura 2-Parameter-methode, opent u MEGA en klikt u op bestand en selecteert u vervolgens een bestand of sessie openen. Klik op afstand. Selecteer Paarsgewijze afstanden berekenen en controleer of het .meg-bestand is afgebakend. Beweeg de muisaanwijzer over het vak naast model of methode en klik op de pijl om het vervolgkeuzemenu uit te vouwen. Selecteer het Kimura 2-Parameter-model en klik op OK om het programma uit te voeren. Open het gegevensuitvoervenster om de resultaten weer te geven. Klik op bestand en selecteer vervolgens export- en afdrukafstanden om het resultaat op te slaan. Open de geassembleerde soorten door automatische partitionering of ASAP-webserver. Klik op het oranje vakje met het label, kies een bestand en upload het .fasta-bestand. Scroll naar beneden en klik op go. Als u het clusterresultaat wilt downloaden, klikt u op de lijst voor de rij met de laagste ASAP-score en de hoogste P-waarde. Om vervolgens de boomschatting te starten, opent u MEGA en klikt u op gegevens. Selecteer vervolgens een bestand of sessie openen om het .meg-bestand te laden. Klik op modellen en selecteer vervolgens de beste DNA- en eiwitmodellen vinden of ml om het best passende substitutiemodel te bepalen. Klik op OK in het menu met analysevoorkeuren. Om nu de boom te genereren, klikt u op fylogenie en selecteert u vervolgens de boom met maximale waarschijnlijkheid construeren en testen. Gebruik het meest geschikte vervangingsmodel door op het vakje naast model of methode te klikken en het juiste model te selecteren in het vervolgkeuzemenu. Klik onder fylogenietest op het vak naast test van fylogenie en kies vervolgens de bootstrap-methode in het vervolgkeuzemenu. Klik op het vakje naast het aantal bootstrap-replicaties. Typ 1.000 en klik op OK om de analyse uit te voeren. Zodra het venster met de resulterende structuur wordt geopend, slaat u de sessie op als een .mts- of .mtsx-bestand. Sla de uitvoer ook op als een .newick-bestand en exporteer de boom als een .png afbeelding. Ga voor de PTP-gebaseerde afbakening naar de PTP-webserver. Klik op kies bestand en upload de boom in Newick-formaat. Onder mijn boom is selecteer geworteld. Voer in het vak onder de namen van de outgroup-taxa de outgroup in door de naam van de taxontip te typen. Klik vervolgens, onder maximale waarschijnlijkheidsoplossing, op download afbakeningsresultaten om de PTP ML-uitvoer op te slaan. Op dezelfde manier klikt u onder de hoogst door bayesiaanse ondersteuning ondersteunde oplossing op het downloaden van afbakeningsresultaten om de PTP BI-uitvoer op te slaan. Voor de MPTP-beperking door MPTP gaat u naar de MPTP-webserver. Upload het Newick-bestand door het naar het grijze vierkant te slepen of door op het vierkant te klikken. Zodra de gegevens zijn geladen, klikt u op doorgaan naar selectie outgroup. Selecteer op de specificatiepagina van de outgroup de outgroup door op het selectievakje naast de taxalabels van outgroup-specimens te klikken. Klik vervolgens op modelselectie, selecteer MPTP en klik op visualisatie-opties. Accepteer op de pagina met visualisatieopties de standaardinstellingen. Klik op verzenden. Klik met de rechtermuisknop op de bestanden onder downloadbare bestanden en kies opslaan als om de resultaten op te slaan. Om nu de moleculaire operationele taxonomische eenheden of MOTU te genereren, opent u de boom met behulp van een fotobewerkingsprogramma of PowerPoint. Maak een balk om de resultaten van elke benadering van de afbakening van moleculaire soorten weer te geven. Als alle benaderingen identieke resultaten opleveren voor een bepaalde moleculaire cluster, wijs de cluster dan bij consensus aan als een MOTU. Deze figuur geeft de maximale waarschijnlijkheid weer van genboom- en moleculaire clusteringsresultaten voor boranuskevers op basis van COI 3-priemsequenties en zes afbakeningsmethoden. Alle methoden identificeerden consequent vier MOTUS, Byrrhinus negrosensis, Byrrhinus villarini Byrrhinus A en Byrrhinus B met identieke clustering over de methoden heen. Byrrhinus negrosensis en Byrrhinus villarini waren duidelijk van elkaar gescheiden, ondanks dat ze uit dezelfde locaties kwamen. Sequenties uit vier provincies werden gegroepeerd in Byrrhinus A, die geen sterke geografische structurering vertoonden. Deze figuur toont de clustering van Anisostena-kevers in vier MOTU's, waaronder Anisostena angatbuhay, Anisostena auxilium, Anisostena A en Anisostena B met volledige overeenstemming over de methoden. Anisostena auxilium overlapte geografisch met Anisostena A en Anisostena B, wat aangeeft dat geografie alleen de moleculaire divergentie niet verklaarde.