Herbruikbaar leverbeeldvormingsapparaat: een herbruikbaar 3D-geprinte hulpmiddel voor leverintravitale microscopie

Het algemene doel van deze procedure is om het Herbruikbare Hepatische Beeldvormingsinstrument, of RHIT, te tonen als een baanbrekend hulpmiddel voor het vastleggen van hoogwaardige, dynamische biologische data, vooral in leveronderzoek. Traditionele wetenschappelijke methoden voor het bestuderen van muizen in gecontroleerde experimenten zijn lange tijd gebaseerd op gedragsobservatie, fysiologische monitoring en genetische analyse. De complexiteit van deze studies leidt vaak tot inconsistente of beperkte data-output.

Veel experimenten vertrouwen op gegevens die onvolledig of moeilijk te interpreteren zijn, zoals korte flitsen van laagresolutiebeelden die snel vervagen, waardoor het moeilijk is om langetermijntrends of subtiele veranderingen vast te leggen. Introduceerde RHIT, wat dynamische, hoogresolutie vangst mogelijk maakt voor leveronderzoek en daarbuiten. De techniek die we demonstreren maakt het mogelijk om op maat gemaakte beeldvormingstools te maken met toegankelijke materialen en breed beschikbare 3D-printtechnologie.

Ontworpen voor gebruik in academische en beperkte omgevingen, maakt deze aanpak de snelle ontwikkeling en inzet van apparaten mogelijk om hogeresolutie in vivo imaging te ondersteunen. Ons herbruikbare hepatische beeldvormingsinstrument, of RHIT, is ontwikkeld om de weefselstabiliteit te verbeteren tijdens de intravitale microscopie van de lever. Het modulaire ontwerp van RHIT biedt ruimte aan muizen van verschillende groottes en ondersteunt uitgebreide beeldvorming van dynamische metabole processen met minimale fysiologische verstoringen.

RHIT wordt in één stap vervaardigd met acrylonitril, butadieen, styreen, ABS, een thermoplast dat is geselecteerd vanwege zijn lichte gewicht, thermostabiliteit en mechanische duurzaamheid. Door de materiaaldichtheid aan te passen, absorbeert RHIT effectief beweging veroorzaakt door ademhaling en hartslag, waardoor beeldartefacten worden verminderd en de helderheid verbetert. De chemische traagheid en wateronoplosbaarheid van ABS zorgen voor beschikbaarheid met biologisch weefsel en maken efficiënte reiniging en hergebruik mogelijk.

Om RHIT na te maken, gebruik je een 3D-productontwerpsoftware. Voor dit ontwerp werd de Autodesk Inventor gebruikt. Open Autodesk Inventor en maak een nieuw standaardonderdeel.

Sla het bestand op met de juiste beschrijving. Maak de schets van RHIT op het voorvlak met behulp van de 2D-schetsfunctie maken. Klik op het rechthoekige icoon en plaats de linkerbenedenhoek bij de oorsprong van het schetsvlak.

Teken een tweede rechthoek binnen de eerste om het beeldvenster van RHIT weer te geven. Voeg dimensies toe aan beide rechthoeken met behulp van de dimensiefunctie, zodat alle lengtes en breedtes naar de oorsprong en ten opzichte van elkaar worden verwezen. Pas de RHIT-afmetingen aan volgens de muisgrootte.

Voeg dikte toe aan RHIT door alleen de buitenste rechthoek te selecteren en extrudeer de schets met het extrudegereedschap om een opening in het midden te laten. Selecteer het onderste vlak van de geëxtrudeerde RHIT en start een nieuwe 2D-schets met de start 2D-schetsfunctie. Teken een rechthoek om het vakje voor het warmtekussen te definiëren.

Definieer de afmetingen van de rechthoek op basis van de grootte en dikte van het warmtekussen dat in deze gleuf wordt geplaatst. Deze metingen moeten overeenkomen met het fysieke warmtekussen dat gebruikt moet worden om een nauwkeurige temperatuurmodellering van het zoogdier te garanderen. Pas de vereiste afmetingen toe met behulp van de dimensie-functie.

Verlaat de 2D-schets en voer een materiaalverwijdering uit met het gesneden extrudegereedschap om een diepe holte voor het warmtekussen te creëren. Zoom in op het gewenste moment om de schets precies te positioneren. Begin een nieuwe schets voor de temperatuurprobe op hetzelfde vlak als de holte.

Klik op Start a 2D sketch en selecteer het cirkel-icoon. Plaats de cirkel op het vlakke oppervlak en maak de afmetingen dienovereenkomstig. Verlaat de sketch-modus.

Klik op extruderen en selecteer de schets van de cirkel. In extrusiemodus klik je op snijden, extruderen en materiaal verwijderen. Plaats de cirkel aan de rechterkant van het gezicht met de pocket-insert.

Het hoeft nog niet gecentreerd te zijn. Voeg afmetingen toe om het uit te lijnen met het midden van de dikte van RHIT. Klik extrudeer.

Er verschijnt een pop-up met een pijl die de richting van de snede aangeeft, samen met de optie 'door alles'. Selecteer alles om het hele materiaal door te snijden en klik dan op oké. Verlaat de extrusiemodus.

Voeg afrondingen toe aan de randen van het venster door op het afrondingsicoon te klikken en selecteer alle acht scherpe randen. Voeg filletgrootte toe en sluit filletmodus af. Bereid het model voor op 3D-printen door naar het tabblad omgeving te navigeren en 3D-printtabblad te selecteren.

Om de ongewijzigde RHIT te printen, importeer je het STL-bestand, hetzij uit figuur 1A of de aanvullende materialen, in A 3D-printvoorbereidingssoftware. Klik op importeren, selecteer het bestand en klik op voorbereiden om het model in afdrukbare lagen te snijden. Kies een compatibele commerciële 3D-printer en klik op printen.

Houd het printproces in de gaten. Als het klaar is, verwijder en maak je de geprinte RHIT zorgvuldig schoon wanneer nodig. Wacht 10 tot 15 minuten na de ejecties voordat je begint met de operatie en beeldvorming.

Voorbereiding van de microscoop en gebruik van RHIT. Bereid een conventionele omgekeerde confocale microscoop voor lever IBN, zoals weergegeven in figuur 2A. Steek de stage-adapter in om het sample te plaatsen.

Voor dit protocol werd een op maat gemaakte metalen insert gebruikt met een ronde opening van 35 millimeter en een glazen afdekking van 40 millimeter. Maak beide zijden van het dekselglas grondig schoon voor en na de beeldopname, waarbij je indien nodig 70% ethanol gebruikt. Bevestig de juiste RHIT op basis van muisgrootte met tape door het RHIT-diafragma uit te lijnen met het objectieflens, parallel aan de beeldbedekkingsslip, zoals getoond in figuur 2G, op het metalen inzetstuk met tape over het afdekglas.

Selecteer het objectief voor beeldvorming op basis van een on-area grootte, ruimtelijke resolutie en beeldtijd, zoals een 25X per 95 water objectief. Richt het objectief dicht bij het afdekglas. Bevestig een strook gaas met tape over het natte raam.

Dit helpt het weefsel te positioneren en het te scheiden van andere buikorganen. Voorverwarmen van RHIT met een warmtepad dat in de gleuf wordt geplaatst en de warmteprobe naast de RHIT bevestigt, zoals weergegeven in figuur 2G tot H. Dit houdt de lichaamstemperatuur van de muis tijdens de beeldvorming op peil. Scheer de buikvacht met een haarknipper en/of ontharingscrème.

Verplaats haarresten en desinfecteer de blootgestelde huid met 70% ethanol. Afhankelijk van de institutionele IACUC-vereisten kan afwisselend een scrub van Betadine en ethanol worden gebruikt om een passende voorbereiding op de operatielocatie te waarborgen. Beoordeel de diepte van de anesthesie opnieuw vóór de operatie aan het dier.

Maak de lever bloot door een horizontale, halvemaanvormige incisie van twee tot drie centimeter onder de ribbenkast te maken met een chirurgische schaar van de xiphoïde, eindigend aan de linkerzijde van de bovenbuik. Maak na de eerste incisie voorzichtig een kleinere sectisie in de spierlaag om de linkerkwab van de lever bloot te leggen. Kauteriser indien nodig om bloedingen te voorkomen.

Voorkom hitteschade aan de lever tijdens het gebruik van de cauterizer door een met zoutoplossing doordrenkt gaas tussen de lever en de spierlaag te plaatsen om de uitgaande warmte van de spier op te nemen. Vermijd overmatig bloedverlies, chirurgisch of mechanisch trauma, of externe compressie. Zodra de lever is blootgesteld, breng je de muis over naar de microscoopfase.

Positie van de muis op het microscooppodium. Plaats de buik van de verdoofde muis met het gezicht naar beneden bovenop het RHIT-platform van de microscoop. Stel de neuskegel zo aan dat de muis onder narcose blijft.

Gebruik een met zoutoplossing doordrenkte wattenapplicator om voorzichtig de linker laterale kwab van de lever tegen de deksel te leiden terwijl er voorzichtig externe druk op de borstholte wordt uitgeoefend. Maak gebruik van de zwaartekracht om de lever voorzichtig naar buiten te manoeuvreren en op het afdekglas te plaatsen. Gebruik een gaasstrip om de lever voorzichtig van het lichaam van de muis te scheiden.

Controleer de neuskegel opnieuw om te zorgen dat de muis onder narcose blijft tijdens de beeldvorming. Voorkom weefseluitdroging door een watergebaseerde gel aan te brengen rond de randen van de blootgestelde holte en direct contact met het warmtekussen te vermijden. Een microscoop met een afgesloten vochtigheidskamer kan ook helpen om temperatuur en luchtvochtigheid te behouden.

Breng oogzalf aan op de ogen om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen. Tot slot stel je timelapse IVM in om te beginnen met beeldvorming. Open laserluiken, evalueer fluorescentielabeling en identificeer een stabiel interessegebied met een opvallende bloedstroom.

Selecteer geschikte beeldverwervingen, waaronder formaat, snelheid, beeldintervals en tijdsduur, framegemiddelde, enzovoort. Definieer indien nodig de boven- en ondergrens voor Z-stacks en start met timelapse-opname. Om ons protocol te valideren, hebben we de beeldstabiliteit gekwantificeerd met behulp van de structurele gelijkheidsindex, of SIM, zoals weergegeven in figuur 3D.

SIM vergelijkt twee beelden op basis van luminantie, contrast en structurele patronen. Een waarde van één duidt op perfecte gelijkenis, terwijl nul vervorming weerspiegelt. Figuur 3C toont dat RHIT consequent de hoogste SIM-waarden oplevert, tot wel 50 keer hoger dan geen insert, wat een superieure beeldkwaliteit aantoont.

Op afbeeldingen gelabeld A tot en met C vergeleken we lever-IVM zonder stabilisator, met het kartoningelegde materiaal en met RHIT. RHIT behoudt een duidelijke resolutie van lipidendruppels in magenta, kernen in groen en bloedvaten in cyaan. Zwart-wit insets benadrukken de stabiliteit van het beeld.

RHIT maakte ook langdurige IBM in obese muizen mogelijk voor meer dan acht uur, zoals te zien is in film één. Samen bevestigden deze resultaten dat RHIT de beeldkwaliteit en reproduceerbaarheid tussen aandoeningen aanzienlijk verbetert. Gezamenlijk vereenvoudigt RHIT de complexe opzet die traditioneel nodig is voor lever-IBM, waardoor zowel reproduceerbaarheid als toegankelijkheid worden verbeterd.

Deze aanpak voorziet in een bredere beweging richting het benutten van 3D-printen voor de standaardisatie van geavanceerde beeldvormingsprotocollen. Naast leverbeeldvorming kunnen de ontwerpprincipes van RHIT worden uitgebreid naar andere toepassingen, waaronder orgaantomografie, materiaalkunde en techniek, waarbij bewegingsstabiliteit cruciaal is voor beeldgetrouheid.