De druppeloverdrachtsmethode gebruiken om op betrouwbare wijze gigantische unilamellaire blaasjes te bereiden

We streven naar celachtige microrobots die door lichaamsweefsels navigeren om therapieën lokaal toe te dienen. Ze zijn gebaseerd op gigantische unilamellaire blaasjes en een fosfolipidenmembraan en bevatten actieve deeltjes. Dit protocol biedt een gids voor beginners die de druppeloverdrachtsmethode willen toepassen en aanpassen in de synthetische biologie en op andere gebieden, bijvoorbeeld in de microrobotica.

In vergelijking met andere GUV-bereidingstechnieken biedt dit protocol een hoge inkapselingsefficiëntie en eenvoudige uitvoering, waardoor het toegankelijk is voor elke onderzoeksgroep met basislaboratoriumapparatuur. We zullen de navigatie van GUV-gebaseerde microrobots in weefselachtige omgevingen beoordelen en detectiestrategieën implementeren om autonome beweging naar zieke cellen mogelijk te maken. Verplaats om te beginnen de handschoenkamer naar binnen of naast een chemische kap.

Open de handschoenkamer en plaats een kristallizator gevuld met silicadeeltjes op de bodem van de kamer. Bedek de kristallisater met een wit steunvlak en leg hem vervolgens op keukenpapier. Breng alle benodigde materialen in de handschoenenkamer en plaats de glazen injectieflacon met de chloroformoplossing op een kurkringhouder of een bekerglas van 150 milliliter dat zo dicht mogelijk bij de kant van de bediener is geplaatst.

Sluit nu de handschoenkamer en zorg ervoor dat de twee helften stevig zijn uitgelijnd en niet kunnen verschuiven. Gebruik de meegeleverde plastic schroeven om de kamer volledig af te dichten. Sluit de uitlaatklep en dompel pijp nummer vijf onder in een bekerglas van 500 milliliter dat voor de helft gevuld is met water.

Sluit vervolgens het door de klep geregelde uiteinde van leiding nummer twee aan op de vacuümleiding. Sluit vervolgens het andere uiteinde aan op de stikstofleiding met behulp van leiding nummer drie. Open het ventiel en zet de vacuümleiding aan totdat de handschoenen zijn opgeblazen en te stijf zijn geworden om te buigen.

Sluit vervolgens zowel de vacuümleiding als de klep. Open vervolgens de stikstofleiding totdat de handschoenen leeglopen en uit de handschoenkamer steken. Gebruik na het aantrekken van handschoenen een Hamilton-spuit om het gespecificeerde volume DOPC in chloroformoplossing over te brengen in een injectieflacon van donker glas.

Sluit de injectieflacon af met de dop met de naalden. Sluit nu leiding nummer zes aan op leiding nummer acht en pijp nummer zeven op leiding nummer negen met behulp van de tweerichtingsverbindingen. Haal de handschoenen uit de handschoenenkamer en open de uitlaatklep.

Open vervolgens langzaam de stikstofleiding en controleer de gasstroom op bellen in de beker. Verhoog geleidelijk de stikstofstroom totdat een gestage maar waarneembare borrelsnelheid is bereikt. Sluit na drie minuten doorstroming de stikstofleiding.

Zodra de laatste bel de beker verlaat, sluit u de uitlaatklep. Trek de handschoenen weer aan en koppel de leidingen acht en negen los van de tweerichtingsverbindingen. Open vervolgens de injectieflacon en beweeg de dop terug naar de buis van 50 milliliter.

Open vervolgens de oliefles en doe de benodigde hoeveelheid olie in de donkere flacon. Sluit de injectieflacon weer af met de dop, verwijder de handschoenen en open de handschoenenkamer. Draai de verzegelde injectieflacon met lipidensuspensie krachtig gedurende ten minste 30 seconden.

Incubeer het vervolgens 30 minuten op 80 graden Celsius in een waterbad. Nadat u de injectieflacon opnieuw hebt gevortexd, incubeert u deze een nacht bij kamertemperatuur. Knip met een schaar de dop van een buis van vijf milliliter af.

Boor een gat van ongeveer acht millimeter in het midden van de dop voor een P1000 pipetpunt. Als het gat te breed is om op de punt te passen, gooi dan de dop weg en start opnieuw met een nieuwe. Strijk met een strook schuurpapier van twee bij vijf centimeter de randen van het geboorde gat glad.

Plaats de dop terug op de buis van vijf milliliter en centrifugeer gedurende vijf minuten op 3.000 g om eventuele resterende plastic deeltjes te verwijderen. Verwijder vervolgens de dop en gooi de tube weg. Snijd nu de dop van een nieuwe buis van vijf milliliter en vervang deze door de voorbereide dop met gaten.

Steek een P1000-punt door het gat met een O-ring die tussen de punt en de dop is vergrendeld om verdere neerwaartse beweging te voorkomen. Vul de tube met 5,5 milliliter buitenoplossing via de punt. Draai de eerder voorbereide injectieflacon met lipidensuspensie gedurende ten minste 30 seconden.

Incubeer het vervolgens 30 minuten in het waterbad van 50 graden Celsius. Laat de eerder bereide wateroplossingen minimaal 10 minuten bij kamertemperatuur in evenwicht komen. Piket nu 300 microliter buitenoplossing in een buis van 1,5 milliliter of de eerder gewijzigde buis van vijf milliliter.

Breng langzaam 100 microliter lipidensuspensie aan op de olieoplossing en zorg voor de vorming van twee verschillende en continue fasen. Laat de interface 10 minuten ongestoord staan om in evenwicht te komen. Piket in een buisje van twee milliliter 250 microliter lipidensuspensie, gevolgd door 6,25 microliter binnenoplossing om een emulsie van 2,5% water in olie te bereiden.

Meng de twee fasen tot de emulsie homogeen en stabiel lijkt. Breng 200 microliter van de voorbereide emulsie over op de eerder gevormde lipidensuspensie-interface van de olieoplossing. Als u een tube van 1,5 milliliter gebruikt, sluit u de tube gewoon.

Als u de aangepaste buis van vijf milliliter gebruikt, plaatst u een rubberen dop op de pipetpunt en brengt u de hele buis voorzichtig over in een conische buis van 50 milliliter. Centrifugeer de buisjes bij kamertemperatuur met de juiste snelheid. Controleer na het centrifugeren of er een ondoorzichtige pellet op de bodem aanwezig is en of de oliefase aan de bovenkant helder is.

Om olie uit de slang van vijf milliliter met GUV's te verwijderen, haalt u de pipetpunt uit de buis en zorgt u ervoor dat de rubberen dop op zijn plaats blijft. Gooi de punt weg en bewaar de rubberen dop, O-ring en houd de dop vast voor toekomstig gebruik. Als u in plaats daarvan een buis van 1.5 milliliter gebruikt, gebruikt u een P1000-micropipet om de olieoplossing te verwijderen, zodat er ongeveer 50 microliter overblijft en zorg ervoor dat u de pellet niet verstoort.

Vervang de pipetpunt en suspendeer de pellet vervolgens opnieuw in de resterende 50 microliter van de oplossing. Breng ten slotte het geresuspendeerde materiaal over in een schone buis van twee milliliter. Lipideoplossingen die onder hoge vochtigheidsomstandigheden werden bereid, produceerden gigantische unilamellaire blaasjes met aanzienlijk lagere opbrengsten en een grotere prevalentie van ongeordende aggregaten in vergelijking met die bereid in een kamer met vochtigheidsregeling, hoewel sommige aggregaten nog steeds aanwezig waren in de laatste.

Bij 3.300 g gedurende 20 minuten waren de opbrengst en kwaliteit van met sucrose beladen blaasjes optimaal, terwijl zowel lagere als hogere centrifugatiesnelheden tot ongunstige resultaten leidden, zoals verminderde opbrengst of aggregaatvorming. Minerale olie resulteerde in blaasjes met een grotere gemiddelde diameterverdeling, terwijl siliconenolie AR 20 een significant hoger totaal aantal blaasjes genereerde.