Gelijktijdige 3D-analyse van hartbeschadiging en immuunrespons bij recidorsus acuut myocardinfarct met behulp van fluorescentiemicroscopie

We kijken naar het samenspel van immuuncellen en beschadigd weefsel na een hartinfarct. We streven ernaar de immuunrespons te begrijpen en de hartfunctie te verbeteren. Er werd voorgesteld dat na een myocardinfarct alle drie de belangrijkste cellulaire entiteiten, cardiomyocyten en cellen en immuuncellen tegelijkertijd moeten worden gemoduleerd door multi-targetstrategieën.

Naast gelijktijdige analyse van hartbeschadiging en respons, konden we 3D-lokalisatie naar deze beschadigde gebieden laten zien, die voorheen onbekend was. 3D-analyse, vooral bij het multiplexen van verschillende doelen, biedt een robuustere manier om de cellulaire samenstelling na een hartinfarct te beoordelen. Plaats om te beginnen de geëuthanaseerde muis onder een stereomicroscoop.

Open met een fijne schaar de borstholte en snijd de blootgestelde vena cava superior dicht bij de uitgang van het bloedvat van de ribbenkast naar de nek. Gebruik een naald van 27 gauge die aan een rolpomp is bevestigd en verfuseer het hart in situ via de rechter en linker atriale orakels met PBS dat heparine bevat. Bevestig voldoende hartbloedverwijdering door het vervagen van de oppervlakkige vasculaire tekening van het hart en het witter worden van de longen en lever te observeren.

Snijd het hart samen met ten minste vijf millimeter van de resterende aorta en het omliggende longweefsel weg met behulp van een tang en een schaar en breng het over naar een petrischaal van zes centimeter die is voorgevuld met ijskoude PBS en gaas. Snijd nu het resterende long-, vet- en vaatweefsel weg totdat alleen het hart met ongeveer vijf millimeter aorta overblijft. Breng het hart over naar een schaal die is voorbereid voor aortacannulatie en trek de resterende aorta over een stompe stalen canule van 20 gauge.

Bevestig het aan de canule-inkeping met een mooie 5-0 hechtdraad. Legaat de linker voorste dalende slagader permanent met een 6-0 hechting op de plaats die wordt gebruikt voor de inductie van een gerefused acuut myocardinfarct. Injecteer 400 microliter PBS met 20 microgram NT CD31-antilichaam van de muis, retrograde gelabeld met een LexaFluor 546 via de ingebrachte canule.

Trek de canule voorzichtig uit de aorta en breng het hart over naar een polypropyleen reactiebuis van 15 milliliter met 10 milliliter 4% paraformaldehyde. Incubeer de buis een nacht bij vier graden Celsius in het donker zonder te roeren. Was het gefixeerde hart in drie vervingen van vijf milliliter PBS gedurende elk 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker, met behulp van rotatie bijna boven het hoofd voor agitatie in polypropyleen reactiebuizen van vijf milliliter.

Dehydrateer het gefixeerde hart in vijf milliliter 50% ethanol in gedeïoniseerd water gedurende ten minste twee uur bij kamertemperatuur in het donker, en agitreer met bijna-bovenhandse rotatie in reactiebuizen van vijf milliliter. Om het gedehydrateerde hart te bleken, brengt u het over naar een reactiebuis van 15 milliliter met 10 milliliter 100% ethanol met 5% dimethylsulfoxide en 5% waterstofperoxide, en incubeert u het vier uur lang bij vier graden Celsius in het donker zonder te roeren. Was het gebleekte hart driemaal gedurende 12 uur in vijf milliliter 100% ethanol bij kamertemperatuur in het donker, met behulp van rotatie bijna boven het hoofd voor agitatie in reactiebuizen van vijf milliliter.

Breng het hart over naar een reactiebuis van vijf milliliter met vier milliliter ethylcinnamaat en incubeer het zonder te roeren gedurende drie dagen bij kamertemperatuur in het donker. Knip de geklaarde gel- en kauwgomblokken op een grootte die het geklaarde hart stabiliseert in de houder van het microscoopmonster. Gebruik een objectieflens met een numerieke apertuur van 0.1 met een werkafstand van 17.6 millimeter voor het vastleggen van beelden.

Detecteer vervolgens de fluorescentiesignalen met behulp van de juiste excitatie- en emissiefilterinstellingen. Voor beeldvorming met lichte plaatmicroscopie kiest u een numerieke apertuur van 0,079, wat resulteert in een lichte plaatdikte van vijf micrometer. Stel de afstand tussen twee afzonderlijke Z-vlakken in op 10 micrometer.

Gebruik een plaatbreedte van 100% om een homogene verlichting van het monster te bereiken. De representatieve hartplakjes die het risicogebied lokaliseren, endotheelbeschadiging en geïnfiltreerde neutrofielen met behulp van meerkanaals antilichaamkleuring en autofluorescentie worden in deze figuur geïllustreerd. Het risicogebied werd geïdentificeerd door afwezigheid van CD31-kleuring na retrograde injectie, endotheelbeschadiging door intraveneuze CD31-negativiteit en infiltrerende neutrofielen door Ly6G-positieve vlekken, meestal in de buurt van letselzones.

3D-weergaven toonden overlap tussen AAR, endotheelbeschadiging en neutrofielenclusters, wat wijst op regiospecifieke immuunlokalisatie. Kwantificering toonde 90,2% van de neutrofielen in AAR versus 9,8% in afgelegen regio's, wat wijst op gelokaliseerde ontsteking. Binnen AAR bevond 79,3% van de neutrofielen zich buiten de endotheelletselvolumes en 20,7% erin, wat wijst op perifere clustering rond schade.