Isolatie, kweek en karakterisering van prostaatkanker-geassocieerde fibroblasten

We streven ernaar het mechanisme te begrijpen waarmee kanker-geassocieerde fibroblasten bijdragen aan tumorprogressie bij prostaatkanker met als doel deze overspraak als therapeutische strategie te neutraliseren. Verschillende populaties van CAF's met verschillende eigenschappen kunnen worden beoordeeld in 3D-organoïden die zijn verkregen met behulp van tumor- en stromale cellen op verschillende manipulaties. Ons protocol maakt het mogelijk om op betrouwbare wijze CAF's te genereren voor deze doeleinden.

De belangrijkste uitdagingen zijn de betrouwbare isolatie van tumor en normale cellen uit de micro-omgevingen van dezelfde patiënt, heterogeniteit, afwezigheid van specifieke CAF-markers, de plasticiteit van CAF's en de beperkte in vitro modellen die de TME-complexiteit samenvatten. Met vergelijkbare methoden hebben we de fundamentele pro-tumorrol van de transcriptiefactor STAT3 en zijn doelwitgenen in CAF's voor borstkanker bij muizen gekarakteriseerd, waarbij we hun werkzaamheid als therapeutische doelen aantonen. Een optimale isolatie van fibroblasten uit de tumor en de aangrenzende normale gebieden van radicale prostatectomiemonsters verkregen van prostaatkankerpatiënten met behulp van een kleine hoeveelheid weefsel.

Weeg om te beginnen de weefselmonsters op de balans op de eerste dag voor fibroblastisolatie. Breng het weefsel met een steriele tang over in schaaltjes van zes centimeter. Was de tissue twee keer in vier milliliter ijskoud PBS en twee keer in vier milliliter ijskoude complete DMEM.

Breng nu het weefsel over in een plaat van zes centimeter op ijs. Voeg een milliliter met antibiotica gesupplementeerde DMEM toe aan het bord. Gebruik vervolgens een schaar of mesjes om het weefsel in fragmenten kleiner dan een vierkante millimeter te hakken.

Breng het gehakte weefsel over in een conische buis van 15 milliliter met daarin vijf milliliter ijskoude complete DMEM. centrifugeer de suspensie vervolgens gedurende vijf minuten bij 754 g bij vier graden Celsius. Verwijder met een pipet van 10 milliliter de supernatant.

Resuspendeer de pellet in vijf milliliter ijskoude complete DMEM en centrifugeer opnieuw. Na het verwijderen van het supernatant suspendeert u de korrel opnieuw in collagenase II-oplossing. Breng de suspensie over in microbuisjes van 1,5 milliliter.

Sluit de microbuisjes af met paraffinefilm. Zet ze vervolgens op 37 graden Celsius voor een nachtelijke spijsvertering met continu schommelen gedurende acht tot 12 uur. Breng de volgende dag de verteerde monsters over in conische buisjes van 15 milliliter.

Pipetteer vijf milliliter ijskoude complete DMEM om collagenase te inactiveren. centrifugeer de suspensie vervolgens gedurende vijf minuten bij 754 g bij vier graden Celsius. Resuspendeer de pellet in één milliliter 0,05% trypsine-EDTA na het uitpipetteren van het supernatant.

Incubeer gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius en schud af en toe. Piket vervolgens een milliliter vers bereide DNase I-oplossing op de monsters en meng goed. Na het centrifugeren en verwijderen van het supernatant, resuspendeert u de pellet in vijf milliliter koude volledige DMEM en centrifugeert u opnieuw.

Resuspendeer de resulterende cellen in volledige DMEM aangevuld met 20% foetaal runderserum. Leg de cellen op een plaat en incubeer bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide en 95% vochtigheid gedurende ten minste drie dagen. Onderzoek na drie dagen de cellen op morfologie en levensvatbaarheid.

Zodra de cellen samenvloeien, plaatst u ze in een schaal van 10 centimeter met volledige DMEM met 20% foetaal runderserum. Plaatkanker-geassocieerde fibroblasten of normale fibroblasten bij 70% samenvloeiing in platen met 12 putjes. Voeg de volgende dag 0,45 gram agar met een laag smeltpunt toe aan 12,5 milliliter PBS in een conische buis van 50 milliliter onder steriele omstandigheden.

Los het mengsel op met behulp van een magnetron. Koel de agaroplossing af tot 37 graden Celsius. Verdun vervolgens in een verhouding van één tot vier met voorverwarmde complete DMEM om een werkende oplossing te bereiden.

Zuig het medium op van de plaat met 12 putjes. Pipetteer 500 microliter van de werkende agar-oplossing in elk putje. Incubeer gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius om agarstolling mogelijk te maken.

Houd ondertussen de resterende agaroplossing op 37 graden Celsius. Trypsiniseer de tumorcellen en bereid een celsuspensie van 20.000 cellen per milliliter. Meng gelijke volumes van de tumorcelsuspensie en de agar-oplossing om een eindvolume van zeven milliliter te verkrijgen, goed voor drie technische replicaten per elke aandoening.

Pipetteer meerdere keren op en neer om een gelijkmatige menging te garanderen. Doseer vervolgens 500 microliter van dit mengsel met ongeveer 5.000 cellen bovenop de gestolde basislaag in elk putje. Nadat je de agar 20 minuten bij vier graden Celsius hebt laten stollen, voeg je aan elk putje een milliliter volledige DMEM toe.

Vervang het medium om de dag door zachtjes vanaf de rand van de put te zuigen en vers medium in het midden toe te voegen. Incubeer totdat kolonies gemakkelijk zichtbaar worden. Zodra kolonies zichtbaar zijn, gooi je het kweekmedium weg.

Bekleur vervolgens de kolonies met 200 microliter Nitro blauwe tetrazoliumchloride-oplossing. Incubeer een nacht bij 37 graden Celsius in een bevochtigde broedmachine. Gooi de kleuroplossing de volgende dag weg.

Maak afbeeldingen van bevlekte kolonies met behulp van een stereomicroscoop. Pure fibroblasten werden met succes geïsoleerd. In veel gevallen, vooral in vroege passages, vertoonden kanker-geassocieerde fibroblasten een meer spoelachtige morfologie in vergelijking met normale fibroblasten.

Kwantitatieve analyse bevestigde dat de proliferatie van DU145-cellen die werden behandeld met kanker-geassocieerde fibroblastgeconditioneerde media significant hoger was gedurende 120 uur dan die welke werden behandeld met normale fibroblastgeconditioneerde media of onbehandeld bleven. DU145-cellen die rechtstreeks werden gekweekt met kanker-geassocieerde fibroblasten en normale fibroblasten vertoonden ook een verhoogde proliferatie gedurende 96 uur ten opzichte van de controles. Overeenkomstige groeicurven toonden aan dat co-cultuur met kanker-geassocieerde en normale fibroblasten resulteerde in een vergelijkbare toename van DU145-proliferatie in de loop van de tijd.

Het effect van geconditioneerde media op de proliferatie van DU145 varieerde tussen kanker-geassocieerde fibroblast- en normale fibroblastparen, waarbij vroege passageparen significant sterkere effecten vertoonden dan latere. In tests voor de vorming van zachte agarkolonies verhoogden zowel kanker-geassocieerde als normale fibroblasten het aantal en de grootte van DU145-kolonies in vergelijking met controles, wat wijst op verbeterde verankeringsonafhankelijke groei. Losgeraakte fibroblastlagen gevormd als gevolg van technische problemen verhinderden kolonievorming in sommige replicaten.

Geconditioneerde media alleen bevorderden de vorming van verankeringsonafhankelijke kolonies in DU145-cellen niet.