Amplicon Sequencing met behulp van de Long-Read Sequencing-technologieën
August 29th, 2025
Dit protocol is geoptimaliseerd voor gerichte diepe sequencing van 18 geneesmiddelresistentieregio's in Mycobacterium tuberculosis met behulp van een long-read sequencing-platform, gevolgd door analyse met een tuberculose-specifieke bio-informaticapijplijn die is ontworpen voor long-read gegevens.
Ik onderzoek of draagbare long-read sequencing resultaten kan leveren voor tuberculoseresistente gevoeligheid in beperkte omgevingen met een nauwkeurigheid vergelijkbaar met de goudstandaardmethode, wat toegankelijke, hoogwaardige tuberculosediagnostiek bevordert. Het gebruik van gerichte next-generation sequencing als diagnostisch hulpmiddel voor medicijnresistente tuberculose door een uitgebreid resistentieprofiel te bieden direct uit klinisch monster zonder bio-informatica-expertise. Ons protocol dat gebruikmaakt van long-read sequencing heeft het potentieel om snellere doorlooptijden te bieden, een eenvoudigere workflow dan realtime weerstanddetectie, waardoor uitgebreide TB-diagnostiek mogelijk wordt en het uitbraaktracking in een omgeving met beperkte middelen en minimale infrastructuur wordt verbeterd.
Om te beginnen bereken je 100 nanogram van elk ampliconmonster op basis van de concentratie en breng je het benodigde volume over in een schone PCR-buis. Om de totale massa van amplicons in het monster te bepalen, gebruik je de gegeven formule. Pas het totale volume van elk monster aan op 12,5 microliter met nucleasevrij water.
Meng de monsters voorzichtig door 10 keer op en neer te pipetteren en ze kort te laten draaien in een microcentrifuge. Voeg vervolgens 1,75 microliter eindreparatie- en adenyleringsreactiebuffer toe aan elk monster, gevolgd door 0,75 microliter eindreparatie- en adenyleringsenzymmix. Na het mengen en draaien van de monsters, plaats je de buizen in een thermocycler op 25 graden Celsius gedurende 30 minuten, gevolgd door 65 graden Celsius gedurende 30 minuten.
Voor native barcode-ligatie voeg je de componenten die op het scherm worden weergegeven toe in nieuwe PCR-buizen. Meng de reacties voorzichtig door te pipetteren en kort te draaien met een microcentrifuge. Voeg vervolgens één microliter EDTA toe aan elke buis.
Daarna goed mengen en kort ronddraaien zoals eerder aangetoond. Trek de gebarcodede monsters in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Vortex de DNA-cleanupparels om ze volledig opnieuw te laten ophangen en een volume toe te voegen dat gelijk is aan 0,7 keer het verzamelde monstervolume.
Meng de kraalmonsteroplossing en incubeer het 10 minuten op kamertemperatuur op een HulaMixer. Vervolgens wordt voor het bereiden van twee milliliter 80% ethanol 1.600 microliter pure ethanol gemengd met 400 microliter nucleasevrij water. Plaats de buis vijf minuten op een magnetisch rek totdat het eluaat helder en kleurloos lijkt.
Verwijder en gooi vervolgens het supernatant weg zonder de pellet te verstoren. Was de kralen met 700 microliter vers bereide 80% ethanol en centrifugeer de buis kort. Verwijder na het plaatsen van de buis op het magnetische rek de resterende ethanol.
Verwijder nu de buis van het magnetische rek. Sweef de kralen opnieuw in 35 microliter nucleasevrij water door zacht te knippen en breng 10 minuten uit bij 37 graden Celsius. Plaats de buis terug in het magnetische rek totdat het eluaat helder en kleurloos is.
Vervolgens breng je 35 microliter van het eluaat over in een schone microcentrifugebuis van 1,5 milliliter voor verder gebruik. Voor adapterligatie mengt u de gegeven componenten in een 1,5 milliliter laagbindende microcentrifugebuis. Centrifugeer de buis kort en incubeer 20 minuten op kamertemperatuur.
Vortex de DNA-cleanup pareltjes om ze volledig opnieuw te laten ophangen. Voeg 20 microliter kralen toe aan de tube en meng zachtjes. Incubeer op een HulaMixer gedurende 10 minuten op kamertemperatuur.
Plaats vervolgens de buis op een magnetisch rek om de kralen te pelleten en het supernatant te aspireren zonder de pellet te verstoren. Voeg 125 microliter korte fragmentbuffer toe en tik voorzichtig met de buis om de kralen opnieuw te laten hangen. Centrifugeer kort en zet de buis terug in het magnetische rek.
Aspireer het supernatant opnieuw nadat de kralen zijn gepellet. Verwijder nu de buis van het magnetische rek en suspendeer de kralen opnieuw in 15 microliter elutiebuffer door zacht te pipetteren of te klikken. Centrifugeer de buis kort om de inhoud te verzamelen, en incubeer hem dan 10 minuten op 37 graden Celsius om het DNA te elueren.
Plaats de buis op een magnetisch rek totdat het eluaat helder en kleurloos is. Vervolgens aspireer je 15 microliter eluaat en breng het over in een schone microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Om de flow cell priming-oplossing voor te bereiden, meng je de betreffende componenten grondig.
Open de primingpoort van de flowcel, aspireer ongeveer 20 microliter buffer om luchtbellen te verwijderen, en laad 800 microliter primingmengsel in de poort zonder luchtbellen toe te voegen. Om de DNA-bibliotheek voor te bereiden, meng je de componenten die op het scherm worden getoond grondig. Tilt voorzichtig de dop van de monsterpoort van de flowcel op en laad 200 microliter primingmengsel in de primingpoort zonder luchtbellen toe te voegen.
Na het mengen van de voorbereide DNA-bibliotheek laad je 75 microliter van de bibliotheek dropwise in de sequencing flow cell sample port. Sluit de dop van de flow cell sample port, zodat de stop veilig in de monsterpoort komt, en sluit vervolgens de primingpoort stevig. Gelelektroforese bevestigde de integriteit van de amplicon in bijna alle monsters, maar banen die overeenkwamen met samples 89 en 136 vertoonden vage of afwezige banden.
Monsters 89 en 136 hadden onvoldoende ampliconconcentraties, waardoor ze werden uitgesloten van de long-read sequencing. Over alle gerichte genen bereikten de long-read en short-read platforms hoge dekkingsdieptes, waarbij het EIS-gen de hoogste gemiddelde waarden liet zien en het RRS-gen de laagste dekkingsdieptes. Ondanks de variatie in dekkingsdiepte behielden beide platforms een hoge dekkingsbreedte van 99,9% over alle resistentie-geassocieerde genen.
Resistentievarianten voor ethambutol, fluoroquinolonen, kanamycine, amikacine en capreomycine werden met 100% concordantie gedetecteerd over short- en longread-sequencingplatforms. Er werden geen resistentie-geassocieerde mutaties gevonden voor linezolide, bedaquiline en clofazimine met beide sequencing-methoden. Streptomycineresistentiedetectie toonde een lagere concordantie tussen platforms, met slechts 71,43% overeenkomst.
De detectiegevoeligheid voor belangrijke genen rpoB, katG/fabG1/ahpC/inhA, fabG1/inhA en pncA varieerde tussen platforms van 89,47% en 96,77%.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie onderzoekt het gebruik van draagbare long-read sequencing voor het bepalen van de gevoeligheid voor geneesmiddelresistente tuberculose (TB) in omgevingen met beperkte middelen. Het protocol heeft als doel nauwkeurige resultaten te leveren die vergelijkbaar zijn met gouden standaardmethoden, waardoor toegankelijke TB-diagnostiek wordt verbeterd.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Genomics
- Besmettelijke ziekten
Achtergrond
- Geneesmiddelresistente tuberculose is een belangrijke mondiale gezondheidsuitdaging.
- Traditionele diagnostische methoden kunnen beperkt zijn in omgevingen met weinig middelen.
- Long-read sequencing biedt mogelijke voordelen op het gebied van nauwkeurigheid en doorlooptijd.
- Bioinformatica-expertise is vaak een belemmering voor effectieve diagnostiek.
Doel van het onderzoek
- Om de effectiviteit van long-read sequencing voor TB-diagnostiek te evalueren.
- Om een uitgebreid resistentieprofiel van klinische monsters te verstrekken.
- Om de workflow voor het detecteren van geneesmiddelresistentie te vereenvoudigen.
Gebruikte methoden
- Targeted next-generation sequencing van 18 geneesmiddelresistentie-gebieden.
- Gebruik van een tuberculose-specifiek bioinformatica-pijplijn.
- Monstervoorbereiding met nauwkeurige meting van amplicons.
- Aanpassing van monstervolumes voor optimale sequencingresultaten.
Belangrijkste resultaten
- Long-read sequencing toonde nauwkeurigheid die vergelijkbaar is met gouden standaarden.
- Snellere doorlooptijden werden bereikt in vergelijking met traditionele methoden.
- Het protocol maakte uitgebreide TB-diagnostiek mogelijk.
- Verbeterde uitbraaktracking was mogelijk in omgevingen met beperkte middelen.
Conclusies
- Draagbare long-read sequencing kan TB-diagnostiek in omgevingen met beperkte middelen verbeteren.
- De methode vermindert de behoefte aan uitgebreide bioinformatica-expertise.
- Deze aanpak heeft het potentieel om TB-beheersings- en controlestrategieën te transformeren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Portable long-read amplicon sequencing enables rapid, comprehensive detection of drug resistance mutations in tuberculosis directly from clinical samples, addressing critical diagnostic gaps in resource-limited settings. This approach supports predictive confidence in resistance profiling and accelerates actionable insights for infectious disease portfolio management. Its deployment can de-risk early diagnostic decisions and expand access to high-quality molecular testing across diverse geographies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of resistance-associated genetic variants in clinical isolates.
- Supports functional validation of resistance mechanisms for target prioritization.
- Facilitates mechanistic de-risking by confirming variant-drug associations.
- Improves predictive confidence in resistance marker selection for diagnostic development.
Screening & Assay Development
- Prepares validated amplicon panels for high-throughput resistance screening workflows.
- Delivers quantitative variant frequency data to inform assay sensitivity thresholds.
- Supports reproducible detection of high-frequency resistance mutations across platforms.
- Enables scalable deployment of portable sequencing for decentralized testing.
Translational & Preclinical Research
- Aligns resistance variant detection with translational biomarker strategies for infectious disease programs.
- Ensures continuity from discovery of resistance markers to preclinical validation of diagnostic assays.
- Provides risk-adjusted data for advancing diagnostic candidates targeting drug-resistant TB.
- Supports outbreak tracking and surveillance in translational research settings.
Pipeline & Workflow Integration
This sequencing protocol bridges early discovery, assay development, and translational research by enabling rapid, field-deployable resistance profiling and supporting data-driven advancement of diagnostic assets.
- Discovery Biology: Confirms resistance mechanisms and variant-drug relationships in clinical samples.
- Screening: Provides quantitative, reproducible variant detection for assay optimization.
- Analytics: Generates high-coverage, cross-platform concordant data for resistance-associated genes.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and outbreak surveillance in preclinical pipelines.
- Enterprise Reuse: Offers a portable, scalable sequencing capability adaptable to multiple infectious disease targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in resistance profiling and target validation.
- Operational Value: Reduces infrastructure requirements and enables rapid, decentralized testing.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions for diagnostic development and deployment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of diagnostic assets for drug-resistant pathogens.
Implementation Considerations
- Requires expertise in amplicon preparation and sequencing workflow execution.
- Needs access to portable long-read sequencing instrumentation and bioinformatics pipelines.
- Demands cross-team standardization for sample handling and data analysis.
- Must adapt protocols for variable sample quality and amplicon yield.
- Detection of low-frequency variants may be limited compared to high-accuracy short-read platforms.
