Fluorescentiegeleide matrix-geassisteerde laserdesorptie/ionisatie met lasergeïnduceerde postionisatiemassaspectrometrie van individuele neurale cellen van ratten
23 mei 2025
Dit protocol schetst het gebruik van microMS voor fluorescentiegeleide, eencellige MALDI-2-massaspectrometrie, waardoor verbeterde moleculaire profilering van primaire neuronale cellen van ratten mogelijk is.
Ons onderzoek richt zich op het ontwikkelen van high-throughput, beeldgeleide, eencellige MALDI-massaspectrometrieworkflows om cellulaire heterogeniteit aan het licht te brengen en de moleculaire profielen te koppelen aan celidentiteit, functie en respons in complexe systemen.
Geavanceerde instrumentatie, zoals MALDI-2 en massaspectrometers met hoge ruimtelijke resolutie, maken gerichte, ruimtelijk opgeloste analyse van afzonderlijke cellen mogelijk, waardoor de gevoeligheid wordt verbeterd en de reikwijdte van moleculaire profilering in complexe weefsels wordt uitgebreid. De huidige uitdagingen zijn onder meer beperkte gevoeligheid, reproduceerbaarheid in steekproeven en complexe gegevensanalyse. MALDI-gegevens zijn vaak schaars en grote datasets met duizenden cellen en honderden moleculen vereisen robuuste rekentools.
Dit protocol pakt de kloof aan in high-throughput-methoden voor het analyseren van individuele cellen en zelfs organellen, waardoor zeer gedetailleerde studies van heterogeniteit mogelijk worden en inzicht wordt verkregen in de moleculaire en cellulaire biologie en functie.
Dit protocol maakt een snelle, gerichte analyse mogelijk van cellen die over het objectglaasje zijn verspreid, waardoor celmanipulatie of scannen van het volledige gebied overbodig wordt en de doorvoer aanzienlijk wordt verhoogd.
[Verteller] Spoel om te beginnen elk glaasje af met twee tot drie milliliter 150 millimolair ammoniumacetaat om glycerol- en zoutkristallen te verwijderen die de toepassing van microscopie en MALDI-matrix kunnen verstoren, en droog de objectglaasjes vervolgens onder een zachte stroom stikstof of laat ze volledig aan de lucht drogen. Plaats het gedroogde objectglaasje in de microscooptafel. Stel de microscoop scherp met behulp van ten minste 10 steunpunten die gelijkmatig over het hele objectglaasje zijn verdeeld. Gebruik filters die geschikt zijn voor DAPI en helderveldbeeldvorming om een betegeld fluorescentiebeeld van het hele objectglaasje te verkrijgen met een vergroting van 5x tot 10x, zodat de fiduciale markeringen op de microscopieglaasjes duidelijk in het beeld worden vastgelegd. Naai de tegelafbeeldingen met behulp van microscopiesoftware, zoals ZEN ZEISS. Controleer of de verticaal aangrenzende tegels niet verschoven zijn. Verwerk en exporteer elke samengevoegde afbeelding als een BigTIFF-bestand met behulp van de microscopiesoftware of als een standaard TIFF als de uiteindelijke afbeeldingsgrootte minder dan twee gigabyte is. Los 20 milligram 2,5-dihydroxyacetofenon op in 1,5 milliliter aceton. Plaats de dia's in de houder van de sublimatiekamer en plaats de houder vervolgens in het sublimatieapparaat. Pipetteer de opgeloste matrixoplossing op de keramische wafel en laat de aceton volledig verdampen, sluit vervolgens de sublimatiekamer om deze af te sluiten. Vul de koelvloeistofkamer met een ijswaterbrij en plaats deze stevig op de sublimatiekamer. Zet de vacuümpomp aan en laat het systeem vijf minuten in evenwicht komen. Begin de sublimatie door de kamer gedurende vijf minuten te verwarmen tot 200 graden Celsius. Verwijder na vijf minuten het ijswaterbad uit de kamer. Draai de temperatuur naar 25 graden Celsius en plaats een koellichaam bovenop de kamer. Ontlucht de sublimatiekamer langzaam om de druk te verminderen. Open de kamer en verwijder voorzichtig de schuiven. Open MicroMS en decimeer de BigTIFF-microscopiebeelden met behulp van de beeldgroepoptie voor zowel helderveld- als fluorescentiekanalen. Navigeer naar het hulpprogramma Blobopties en pas de maximale en minimale blobgrootte aan om het acceptabele blobgroottebereik te definiëren. Stel de drempel van het fluorescentiekanaal in voor blobdetectie. Geef de circulariteitswaarde op om te definiëren hoe cirkelvormig de geïdentificeerde cellen moeten zijn om in overweging te nemen en kies de kleur. Gebruik de optie Blob Zoeken om blobs te detecteren. Sla de bloblijst op onder een gewenste naam wanneer u hierom wordt gevraagd. Gebruik de tool Afstandsfilter om de minimale afstand tussen elke cel in te stellen. Test de fout via testpunten om de offsetfout nauwkeurig te bepalen. Laad de dia's in het instrument met behulp van de MTP Slide Adapter II. Nadat u met MicroMS bent teruggekeerd naar de computer, opent u de massaspectrometercomputer via een externe desktoptoepassing. Als u het instrument voor de eerste keer gebruikt, controleert u de positie ervan door naar Extra te gaan, gevolgd door Instrumentinstellingen. Bekijk in het pop-upvenster de set coördinaten met hun X- en Y-posities en selecteer elk van deze specifieke punten op de geometrie van dia-adapter II. Werk de X- en Y-posities in het MicroMS-venster bij. Navigeer met behulp van de camera en de bedieningselementen van de objecttafel van de massaspectrometer naar een gemakkelijk identificeerbare locatie op de dia en kopieer de coördinaten van het instrument. Zoek in MicroMS dezelfde positie in het microscoopbeeld, klik met de rechtermuisknop en voer de coördinaten in het pop-upvenster in. Rond de coördinaten af op de dichtstbijzijnde gehele getallen en scheid ze door een spatie. Nadat er drie registratiepunten zijn toegevoegd, wordt een van de cirkels rood, wat aangeeft dat dit de meest afwijkende positie van de registratie is. Verwijder het registratiepunt met Control + klik met de rechtermuisknop en probeer het opnieuw. Ga onder Bestand naar Opslaan en vervolgens naar Registratie om het registratiebestand op te slaan. Met de blobs zichtbaar op de dia, gaat u naar Bestand, Opslaan en vervolgens naar instrumentposities om het instrumentpositiebestand op te slaan en brengt u dit bestand vervolgens met behulp van externe desktopsoftware over naar de instrumentcomputer. Open het aangepaste XEO-bestand en kopieer de inhoud ervan naar de MTP Slide Adapter II . XEO-bestand op de instrumentcomputer. Sla het bestand op om dit geometriebestand bij te werken met de locaties van de cellen. Klik op het tabblad Automatisering en selecteer Nieuw om een nieuwe automatische uitvoering te maken. Sleep over het weergegeven voorbeeldgebied om de cellen te selecteren en klik met de rechtermuisknop om ze toe te voegen aan de analyselijst. Sla de automatische uitvoering op en klik op Automatische uitvoering starten om de acquisitie te starten. Deze figuur illustreert hoe eencellige MALDI-2-massaspectrometrieprofilering op lipiden gebaseerde cellulaire heterogeniteit tussen en binnen verschillende hersengebieden aan het licht brengt. Uniforme variëteit benadering en projectie, of UMAP-analyse, scheidde cellen door hersengebied en vormde verschillende clusters voor striatum, hippocampus en cortex. Leidse clustering bracht vier subpopulaties van lipiden aan het licht. Bovendien werden clusterspecifieke lipidesignaturen waargenomen, met verschillende intensiteitsprofielen over geannoteerde lipiden. Massaspectra van zes corticale cellen toonden ook consistente lipidedetectie over objectglaasjes. Bovendien vertoonden corticale cellen van verschillende dia's overlappende UMAP-verdelingen, wat wijst op minimale batcheffecten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het gebruik van microMS voor fluorescentie-geleide, enkele-cel MALDI-2 massaspectrometrie, ter verbetering van moleculaire profilering van primaire rat neuronaal cellen. Het onderzoek heeft tot doel cellulaire heterogeniteit aan te pakken en moleculaire profielen te linken aan cellulaire identiteit en functie binnen complexe weefsels.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Massaspectrometrie
- Cellulaire biologie
Achtergrond
- High-throughput beeldgeleide workflows vergemakkelijken studies van cellulaire heterogeniteit.
- Geavanceerde MALDI-2 massaspectrometrie maakt ruimtelijk opgeloste analyse mogelijk.
- Huidige uitdagingen omvatten data-analyse en gevoeligheidskwesties.
- Robuuste computationele tools zijn noodzakelijk voor grote datasets.
Doel van het onderzoek
- Om high-throughput methoden voor het analyseren van individuele cellen te verbeteren.
- Om moleculaire data te linken aan cellulaire identiteit en functie.
- Om inzichten te verbeteren in de biologie van complexe neurale systemen.
Gebruikte methoden
- Het protocol gebruikt enkele-cel MALDI-2 massaspectrometrie voor analyse.
- Het primaire model bestaat uit primaire rat neuronaal cellen.
- Stappen omvatten preparatie van de slide, sublimatie van matrix, en blob-analyse voor celdetectie.
- Gedetailleerde microscopie beeldverwerving en computationele registratie zijn cruciaal.
- Dataverwerking omvat aangepaste software voor het verbeteren van massaspectrometrie resultaten.
Belangrijkste resultaten
- Lipide-gebaseerde cellulaire heterogeniteit over verschillende hersengebieden werd onthuld.
- UMAP analyse slaagde erin cellen per hersengebied te clusteren.
- Cluster-specifieke lipide-signaturen werden geïdentificeerd, waardoor distincte cellulaire profielen werden gehighlight.
Conclusies
- Dit protocol maakt snelle, gerichte analyse van neuronaal cellen mogelijk zonder uitgebreide manipulatie.
- De bevindingen verbeteren het begrip van moleculaire en cellulaire biologie in de neurowetenschap.
- De verkregen inzichten kunnen toekomstige studies over cellulaire functie in complexe weefsels informeren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
High-throughput, fluorescence-guided MALDI-2 mass spectrometry enables precise molecular profiling of individual neural cells, addressing the challenge of cellular heterogeneity in complex tissues. This workflow enhances predictive confidence in early discovery by linking molecular signatures to cell identity and function. The approach supports portfolio decisions by providing scalable, reproducible single-cell data critical for target validation and mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cellular heterogeneity and molecular pathway mapping at single-cell resolution.
- Supports functional target validation by correlating molecular profiles with cell identity and region-specific biology.
- Facilitates predictive confidence in target selection through robust, high-content molecular data.
Screening & Assay Development
- Prepares validated single-cell systems for downstream high-throughput screening workflows.
- Delivers quantitative, reproducible molecular outputs suitable for assay standardization.
- Reduces data size and increases throughput by targeting only cell locations, optimizing screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular profiling with disease-relevant neural systems for translational biomarker discovery.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation by supporting cross-slide and cross-region reproducibility.
- Provides mechanistic de-risking through detailed lipid-based cellular subpopulation analysis.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis testing and translational research in neuroscience and related fields.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven interrogation of neural cell diversity and molecular function.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in single-cell contexts.
- Analytics: Delivers high-content, spatially resolved molecular measurements for robust comparative analysis.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and preclinical model validation with minimal batch effects.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable workflow for single-cell molecular profiling across diverse projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural target validation.
- Operational Value: Standardizes high-throughput, reproducible single-cell analysis with reduced data burden.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing robust, cross-sample molecular data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced mass spectrometry and fluorescence microscopy.
- Demands access to MALDI-2 instrumentation and computational infrastructure for data analysis.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for image registration and data processing.
- Adaptable to various neural and potentially non-neural cell systems with appropriate validation.
- Data analysis complexity and reproducibility across samples are critical practical considerations.
