Visualisatie van retinale organoïden voor de hele berg met cellulaire resolutie

Ons werk richt zich op het ontwikkelen en bestuderen van retinale organoïden die dienen als een menselijk in-vitromodel om te bestuderen hoe het menselijk netvlies wordt gevormd, hoe ziekten van invloed zijn en hoe we ze zouden kunnen behandelen.

Om het onderzoek op het gebied van regeneratieve geneeskunde vooruit te helpen, gebruiken we 3D-retinale organoïden in combinatie met optische klaring en immunolabeling om hele structuren te visualiseren en om de speciale organisatie van retinale cellen te bestuderen met confocale microscopie.

Beeldvorming op de hele berg staat voor uitdagingen, zoals ongelijkmatige penetratie van antilichamen in dichte weefsels en sferische aberratie in organoïden, die oppervlaktebias-labeling en focusverlies veroorzaken tijdens de weefselvisualisatie.

Onze methode onthult retinale celverbindingen, celtypen, onder 3D-organisatie, en biedt cruciale inzichten in de onderliggende oorzaken van netvliesaandoeningen.

[Docent] Verkrijg om te beginnen de fluorofooraliquots opgelost in watervrij DMSO, gedehydrateerd en ingevroren. Voeg 1 tot 10 microliter DMSO toe aan een hoeveelheid. Combineer nu 50 microliter secundair immunoglobuline G of primair antilichaam, zes microliter van één molair natriumbicarbonaat en één tot vijf microliter fluorofoor en incubeer op een schommelplatform gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Terwijl de reactie vordert, verwijdert u de deksels van de uitsluitingskolommen voor zuiveringsgrootte en laat u de buffer doorlaten. Breng de kolom in evenwicht door drie rondes van twee tot drie milliliter PBS door de kolom te laten lopen. Als het laatste evenwicht is voltooid voordat de incubatie eindigt, plaats dan de deksels terug om te voorkomen dat ze trekken en wacht tot de reactie is voltooid. Voeg na incubatie 140 microliter PBS toe aan de etiketteringsreactie om het volume op ongeveer 200 microliter te brengen en draai het. Voeg de oplossing toe aan het midden van de kolom en laat deze de kolom binnenkomen. Nadat de laatste druppel is verdwenen, duwt u de oplossing met 550 microliter PBS. Wanneer de vloeistof stopt met vallen, elueert u met 300 microliter PBS en verzamelt u deze in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Meet de absorptie van het monster bij 280 nanometer en bij de fluorofoorspecifieke golflengten om de antilichaamconcentratie en labelverhoudingen te berekenen. Bewaar de gelabelde antilichamen maximaal zes maanden bij vier graden Celsius, beschermd tegen licht. Fixeer de retinale organoïden met 4% paraform aldehyde gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Voeg na het fixeren antigeenoplossing toe over de organoïden en incubeer het gerecht bij 60 graden Celsius, met mild schudden met 30 omwentelingen per minuut gedurende een uur. Permeabiliseer vervolgens de organoïden met PBS met 1% Triton X-100. Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur, met licht schudden gedurende vier uur. Blokkeer nu de organoïden in 2% BSA met 0,1% Triton X-100 bij kamertemperatuur 's nachts of langer dan een dag. Voeg de volgende dag verdunde primaire antilichamen toe aan de organoïden. Incubeer twee dagen bij vier graden Celsius met licht schudden. Was de organoïden drie keer gedurende 15 minuten elk in een wasoplossing op kamertemperatuur met licht schudden. Voeg nu de secundaire antilichamen van de verdunningsoplossing toe en incubeer gedurende twee dagen bij vier graden Celsius met licht schudden. Na het wassen van de organoïden, zoals eerder gedemonstreerd, incuberen de organoïden met fluorescerende kleurstoffen verdund in wasoplossing bij kamertemperatuur gedurende een uur met mild schudden. Was dan opnieuw. Bereid vervolgens 1-propanoloplossingen in ultrapuur water in concentraties van 15%, 30%, 45%, 60%, 75% en 90% en pas elk aan op pH 9.5 met trimethylamine. Dehydrateer de monsters achtereenvolgens in toenemende gradiënten van 1-propanoloplossingen gedurende elk twee uur bij 30 graden Celsius met licht schudden. Breng het monster vervolgens over naar een 100% 1-propanoloplossing en broed een nacht bij 30 graden Celsius met licht schudden. Bereid voor het klaren van het monster een mengsel van benzylalcohol en benzylbenzoaat in een verhouding van één op twee om een BABB-oplossing te maken. Dompel de monsters een nacht onder in BABB bij kamertemperatuur. Vernieuw de BABB-oplossing voordat u de beeldvorming uitvoert. Plaats de organoïde met een glazen pipet in een petrischaaltje met glazen bodem met een druppel BABB en zorg ervoor dat deze contact maakt met het oppervlak van het afdekglas. Gebruik nu een omgekeerde confocale laserscanmicroscoop met objectieven met lage en hoge vergroting om Z-stack-beelden te verkrijgen voor cellulaire 3D-resolutie. Kalibreer de stapgrootte van de Z-stack-acquisitie opnieuw door rekening te houden met de brekingsindexmismatch tussen clearingoplossing en immersiemedia. Start nu ImageJ, werk de voxeldiepte bij door Afbeelding te selecteren en op Eigenschappen te klikken om beeldprojecties van de Z-stack te maken. Inspecteer de diepte van de Z-stack door Afbeelding te selecteren, vervolgens Stapels en Orthogonale weergaven te kiezen om XY-, XZ- en YZ-weergaven van de retinale organoïde weer te geven. Sla de gewenste regio's op door op Bestand te klikken en Opslaan als te selecteren. Maak ten slotte een animatie van de 3D-render van de Z-stack met behulp van verwerkingssoftware. Fructoseglycerol geklaarde retinale organoïden vertoonden de minste verbetering in transparantie, waardoor de visualisatie van de organoïde kern werd belemmerd. ECI-klaring verbeterde de visualisatie van retinale lagen, maar slaagde er nog steeds niet in om de organoïde kern te onthullen vanwege aanhoudende lichtverstrooiing. Fluoclear BABB-geclearde organoïden vertoonden de hoogste transparantie, waarbij zowel de cortex als de kern duidelijk zichtbaar waren met consistente fluorescentie. Zowel ECI- als fluoclear BABB-geclearde organoïden vertoonden zichtbare krimp in heldere veldbeelden als gevolg van uitdrogingsstappen. Door BABB geïnduceerde krimp verhoogde de compactheid van het monster, waardoor het gebruik van sterk vergrote objectieven mogelijk werd om diepere structuren in beeld te brengen. TUJ1-immunolabeling na 40 dagen in vitro toonde een enkele dunne neuronale laag zonder zichtbare gelaagdheid. Tegen 90 dagen bevolkten de cellen het apicale gebied dicht, en na 170 dagen vertoonde de organoïde duidelijke tekenen van gelaagde organisatie met een gedefinieerde apicale zone. Na 200 dagen strekten langwerpige celprojecties zich van het oppervlak naar binnen uit tot in de kern, en de organoïde ontwikkelde zich na 250 dagen tot drie verschillende retinale lagen. Neuronale vezels strekten zich tijdens de rijping uit van het organoïde centrum naar de periferie en werden in vitro 250 dagen dikker en complexer. Kegelfotoreceptoren die blauwe en groen/rode opsins tot expressie brengen, verschenen in een laat stadium en vertoonden langwerpige morfologieën met heldere uiteinden. Staaffotoreceptoren die rodopsine tot expressie brengen, werden geïdentificeerd aan de hand van hun centrale kernen en perifere opsineverdeling. Chx10-positieve cellen werden aanvankelijk wijd verspreid, maar later specifiek gelokaliseerd in de binnenste nucleaire laag tijdens de rijping van organoïden. Endogene GCaMP6s-expressie bleef behouden na BABB-klaring, waarbij het GFP-signaal na langdurige fixatie in het neurale netvlies kon worden gedetecteerd.