Transmissie-elektronenmicroscopie als visualisatietechniek voor analyse van circadiane synaptische plasticiteit in de cortex van de muizenloop

We zijn geïnteresseerd in neurale plasticiteit, in het bijzonder circadiane veranderingen in plasticiteit van synapsen, neuronen en gliacellen. We proberen een antwoord te geven op de vraag hoe synapsen overdag en 's nachts en onder pathologische omstandigheden worden getransformeerd. De meest recente ontwikkelingen in ons vakgebied zijn het gebruik van verschillende genetische hulpmiddelen om genexpressie te manipuleren, ook met behulp van methoden om veranderingen in de hersenen te visualiseren, en er is een groeiend aantal diermodellen om neurodegeneratieve ziekten te bestuderen. We hebben met behulp van een elektronentransmissiemicroscoop ontdekt dat het aantal synapsen in de vatcortex van muizen overdag en 's nachts verandert. En dit ritme is ook circadiaans, althans in het geval van remmende synapsen. Omdat remmende synapsen, ze nemen 's nachts in aantal toe, terwijl exciterende synapsen overdag toenemen. Soortgelijke veranderingen hebben we gevonden in de hersenen van de fruitvlieg. Bij deze soort verandert ook het aantal synapsen gedurende de dag en nacht. En daarnaast hebben we structurele veranderingen gevonden in de vorm van neuronen en gliacellen.

[Verteller] Neem om te beginnen het cerebellum van de muis en verdeel de hersenen in twee hemisferen. Kies een halfrond en oriënteer deze zo dat secties tangentieel naar de barrelcortex kunnen worden gesneden. Snijd vervolgens de secties op een dikte van 60 micrometer en breng ze over in een oplossing met 0,1-molaire fosfaatbuffer en fixatief in een verhouding van één op vijf. Onderzoek de secties onder een lichtmicroscoop en verzamel alleen die secties die duidelijk de barrel field cortex laten zien. Breng de secties met een penseel voorzichtig over in een klein glazen petrischaaltje. Spoel de hersendelen in 0,1-molair cacodylaat. Fixeer vervolgens de secties in 1% osmiumtetroxide in 0,1-molaire cacodylaatbuffer met 1,5% kaliumferricyanide. Nadat de secties in gedestilleerd water zijn gespoeld, gebruikt u een spuit met een filter van 25 millimeter om langzaam 70% ethanol met 1% uranylacetaat in elke petrischaal met tissues te doseren. Na een nacht incubatie in 70% ethanol bij vier graden Celsius, was je tissues in 80%, 90% en 100% ethanol. Was de tissues vervolgens twee keer in propyleenoxide gedurende elk 10 minuten. Vervang vervolgens propyleenoxide door twee milliliter van een één-op-één mengsel van Poly/Bed-hars en propyleenoxide. Dek af met een deksel en incubeer gedurende 40 minuten. Veranker de hersensecties in twee milliliter van een drie-op-één mengsel van Poly/Bed-hars en propyleenoxide. Dek af en laat 1,5 uur staan. Snijd vervolgens de ACLAR-film in stukken die overeenkomen met de grootte van een standaard glasplaatje. Breng met behulp van een plastic pipet een kleine hoeveelheid hars aan op elk stuk ACLAR-film. Breng met een penseel de hersensecties van de petrischaal over naar de hars op de ACLAR-film. Integreer elke sectie tussen twee ACLAR-films en incubeer om te polymeriseren. Fotografeer met een lichtmicroscoop met een tweevoudig objectief de ingebedde hersensecties. Als u de afbeeldingen wilt openen, klikt u op Bestand en Openen, selecteert u de afbeeldingen terwijl u Shift ingedrukt houdt en klikt u op Openen. Begin met het stapelen van afbeeldingen uit de cortex. Klik met de rechtermuisknop op laag 1 in elke afbeelding, selecteer Laag dupliceren en voer het afbeeldingsnummer in als naam in het dialoogvenster. Kies een afbeelding als doelbestand en klik op OK. Gebruik vervolgens het gereedschap Verplaatsen om de afbeeldingen handmatig uit te lijnen en pas de oriëntatie aan met Bewerken, Transformeren, Roteren of Omspiegelen als dat nodig is. Gebruik voor fijnere aanpassingen Bewerken, Transformeren, Vervormen en verplaats de hoeken afzonderlijk om overeen te komen met anatomische oriëntatiepunten. Stel de overvloeimodus van de bovenste laag in op overlapping in het deelvenster Lagen om de uitlijning te vergemakkelijken. Gebruik in elk gedeelte dat de vatcortex weergeeft een stereomicroscoop om het geselecteerde vat te identificeren en knip het samen met het aangrenzende vat uit met behulp van een scheermesje. Nadat u de sectie in een harsblok hebt ingebed, verzamelt u de ultradunne secties op met vorm beklede nikkelroosters met één sleuf. Na het uitlijnen van de stapel TEM-afbeeldingen, zoals eerder gedemonstreerd, definieert u het analysegebied. Klik op Laag gevolgd door Nieuw en Laag en klik vervolgens op OK. Selecteer het gereedschap Rechthoek, ga naar Laag, Laagstijl, Lijn. Stel de lijnkleur, dikte en positie in op binnen en klik vervolgens op OK. Teken nu een rechthoek om de analysegrens te definiëren en selecteer Vullen 0%. Als u een nieuwe laag voor annotaties wilt toevoegen, selecteert u Laag, Nieuw, Laag en klikt u vervolgens op OK. Gebruik het penseel om synapsen op deze laag te markeren. Gebruik de gereedschappen Zoomen en Handjes om precisie te garanderen tijdens het annoteren. Open nu de afbeeldingsstapel die bedoeld is voor 3D-reconstructie. Selecteer het gereedschap Bijsnijden, markeer het gebied met de dendritische rug over de stapel en druk op Enter om dat gebied in alle zichtbare lagen bij te snijden. Als u slechts één laag tegelijk zichtbaar wilt maken, schakelt u het oogpictogram in het deelvenster Lagen in. Klik op Bestand, Opslaan als, geef het bestand een naam, selecteer JPG-indeling en klik op OK om elke bijgesneden afbeelding afzonderlijk op te slaan. Open de 3D-reconstructiesoftware. Klik voor het uploaden op Z op de navigatiegadget of druk op numpad 7 om het viewportperspectief uit te lijnen. Als u vervolgens de afbeeldingen wilt uploaden, klikt u op Toevoegen, Afbeelding, Verwijzing, selecteert u vervolgens de eerste afbeelding en dubbelklikt u om te bevestigen. Als u de uiteindelijke TEM-afbeelding langs de z-as wilt plaatsen, klikt u op de afbeelding. Voer in het deelvenster Objecteigenschappen in de rechterzijbalk de gewenste waarde in het veld Locatie Z in. Als u alle afbeeldingen gelijkmatig over de z-as wilt verdelen, selecteert u alle afbeeldingsobjecten. Druk op End om het eindpaneel te openen. Navigeer naar het tabblad Bewerken en klik op Z verdelen om ze automatisch te spateren op basis van sectiedikte. Als u de vorm van de dendritische wervelkolom op elke TEM-afbeelding handmatig wilt omlijnen met behulp van één curve per afbeelding, klikt u op Toevoegen, Krommen en Cirkel. Als u de cirkel wilt verplaatsen, houdt u g ingedrukt, sleept u de muis en klikt u vervolgens om de plaatsing te bevestigen. Houd s ingedrukt om de grootte aan te passen en klik vervolgens om te bevestigen. Schaal vervolgens het object zodat het is uitgelijnd met de vorm van de dendritische wervelkolom. Pas nu de gebogen vorm aan zodat deze past bij de grens van de wervelkolom. Selecteer een controlepunt, druk op g, verplaats het punt en klik om te bevestigen. Gebruik de g- of s-toetsen indien nodig om de handgreeppunten aan te passen en de richting en intensiteit van de curve te verfijnen. Als u meer details wilt toevoegen, houdt u Shift ingedrukt en selecteert u twee aangrenzende controlepunten. Klik vervolgens met de rechtermuisknop en kies Onderverdelen om er een nieuw punt tussen in te voegen. Zodra de curve de rug nauwkeurig omlijnt, gaat u naar het tabblad Lay-out, klikt u met de rechtermuisknop op het Bezier-cirkelobject en kiest u Object dupliceren zonder de muis te bewegen. Als u de randen van het samengevoegde object wilt verbinden en een gesloten net wilt vormen, voert u het tabblad Modellering in. Druk op 2 om over te schakelen naar de randselectiemodus. Klik op Selecteren, Alles, klik met de rechtermuisknop en kies Randlussen overbruggen om de randringen aan elkaar te koppelen. Als u de opening boven aan het object wilt opvullen, schakelt u alles uit door ernaast te klikken. Houd Alt ingedrukt en klik op een rand van de bovenste richel om de hele lus te selecteren. Klik met de rechtermuisknop en kies Randen uitzetten, sleep omhoog langs de z-as. Druk nu op s, beweeg de muis naar binnen om de nieuwe lus te verkleinen en klik om te bevestigen. Terwijl de lus nog steeds is geselecteerd, klikt u met de rechtermuisknop en kiest u Nieuw gezicht uit randen. Om de uiteindelijke structuur vloeiender te maken, gaat u naar het tabblad Modificatoren in de rechterzijbalk. Klik op Modifier toevoegen, navigeer naar Genereren en selecteer Subdivisie Oppervlak. Stel de viewport- en renderniveaus in op één voor consistente vloeiendheid. Als u kleur wilt toewijzen aan afzonderlijke structuren, selecteert u het gewenste object. Open het tabblad Materiaal in de rechterzijbalk, klik op Nieuw en stel de basiskleur in. Selecteer het lichtobject om de belichting van de scène aan te passen. Houd g ingedrukt, beweeg de muis om de lamp te verplaatsen en klik om de nieuwe locatie te bevestigen. Om de camera te positioneren voor rendering, richt u de viewport zo dat deze naar de dendritische wervelkolom is gericht zoals deze in de uiteindelijke uitvoer zou moeten verschijnen. Druk op Control + Alt + numpad 0 om de camera vast te zetten op de huidige weergave. Pas het cameraframe aan door het te selecteren, g ingedrukt te houden en te verplaatsen om de kadrering te verfijnen. De somatosensorische cortex van de muis was identificeerbaar, zelfs in ongekleurde hersensecties, en het hele vatveld kon worden gereconstrueerd met behulp van digitale hulpmiddelen, ondanks de verdeling van individuele vaten over meerdere secties. Opeenvolgende ultradunne TEM-beelden maakten de betrouwbare classificatie van synapsen in exciterende of remmende typen mogelijk op basis van serieel visueel bewijs. Driedimensionale reconstructie van dendritische stekels uit seriële secties maakte visualisatie van de morfologie van de wervelkolom mogelijk, waarbij verschillende vormen werden onthuld, zoals dunne, paddestoel, stompe stekels en tussenliggende. De vormen van de wervelkolom werden gekwantificeerd op basis van metingen, waaronder de lengte van de wervelkolom, de neklengte en de diameters van de wervelkolom, het hoofd en de nek.