Een stapsgewijze handleiding voor de isolatie en analyse van bladoppervlak en apoplastisch RNA met behulp van Arabidopsis-rozetten

We proberen te begrijpen hoe planten hun microbioom reguleren en of RNA's die door planten worden uitgescheiden, de genexpressie reguleren in zowel prokaryote als eukaryote microben die planten koloniseren. We gebruiken een combinatie van schaalelektroforese met hoge resolutie en op Illumina gebaseerde analyse om de RNA's op het bladoppervlak te beoordelen en hoe deze veranderen als reactie op biotische stress. Hoewel recente studies suggereren dat extracellulaire RNA's worden opgenomen door schimmel- en bacteriële pathogenen, blijven de onderliggende mechanismen van RNA-opname en functionele gevolgen van deze opname grotendeels onontgonnen.

Neem om te beginnen zes tot zeven weken oude arabidopsis-planten voor elke replicaat. Voeg silhouet L-77 toe aan de steriele VIB, voordat u begint met het isoleren van het oppervlak van het blad. Breng vervolgens met behulp van een maatcilinder 100 milliliter van de bereide VIB-oplossing over in een spuitfles van 500 milliliter.

Maak de arabidopsis-rozetten met een fijne schaar voorzichtig los van hun wortels. Gebruik daarna een zachte borstel om overtollig vuil van de bloembladen te verwijderen. Leg de losgemaakte rozetten op een plat dienblad met het abaxiale oppervlak naar boven gericht.

Spuit vervolgens het abaxiale oppervlak met behulp van vijf pompjes van de spuitfles gevuld met VIB en bevochtigingsmiddel. Draai de rozetten voorzichtig om en spuit het adaxiale oppervlak in. Bereid aangepaste spuiten met gaten aan de onderkant voor door ze met parafilm om de hals te wikkelen om de punt boven de bodem van de fles te hangen.

Om het spoelen van het bladoppervlak te herstellen, plaatst u de gespoten rozetten voorzichtig in de naaldloze gemodificeerde spuiten van 60 milliliter die in centrifugeflessen van 250 milliliter zijn geplaatst en spuit u twee stevige pompen buffer in de spuit. Centrifugeer vervolgens de geladen flessen gedurende 10 minuten bij 10 G bij vier graden Celsius. Filtreer nu het herstelde bladoppervlak, spoel door een spuitfilter van 0,22 micrometer en verzamel het filtraat in een centrifugebuis van 50 milliliter, die op ijs wordt bewaard.

Spuit voor de methode met het uitstrijkje van het bladoppervlak de losgemaakte rozetten in met de VIB- en bevochtigingsmiddeloplossing op dezelfde manier als beschreven in de vorige stap. Om het uitstrijkje van het bladoppervlak te herstellen, gebruikt u steriele wattenstaafjes om zowel de adaxiale als de abaxiale oppervlakken van de rozetten af te strijken. Druk vervolgens de geweekte tips tegen de binnenwand van een centrifugebuis van 15 milliliter om de vloeistof te extraheren.

Filtreer het geëxtraheerde monster van het uitstrijkje van het bladoppervlak door een spuitfilter van 0,22 micrometer in een buis van twee milliliter die op ijs is geplaatst. Plaats dezelfde set planten die eerder werden gebruikt voor het wassen van het bladoppervlak of het isoleren van wattenstaafjes in een schoon bekerglas en spoel ze voorzichtig twee keer af met gedestilleerd water. Om de rozetten vacuüm te infiltreren met VIB, plaatst u de gespoelde rozetten voorzichtig in een Frans perskoffiezetapparaat met 300 tot 500 milliliter VIB.

Sluit het deksel goed af en laat de zuiger voorzichtig zakken totdat de rozetten volledig ondergedompeld zijn. Plaats de Franse pers in een vacuümkamer en pas gedurende 20 seconden een vacuüm toe met behulp van een vacuümpomp totdat de planten goed zijn geïnfiltreerd. Nadat u het vacuüm hebt opgeheven, haalt u de Franse pers uit de kamer en verwijdert u het deksel.

Giet de VIB in een plastic bekerglas van 500 milliliter en verwijder de rozetten. Schud vervolgens voorzichtig de rozetten en borstel de bladeren over een papieren handdoek om overtollige buffer te verwijderen. Dep nu met vloeipapier voorzichtig de bladoppervlakken om eventuele resterende buffer te verwijderen.

Om de aplastische wasvloeistof op te vangen, plaatst u de VIB-geïnfiltreerde rozetten in naaldloze spuiten van 60 milliliter, die zoals eerder in centrifugeflessen van 250 milliliter worden geplaatst. Centrifugeer de flessen op 600 G gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius met langzame acceleratie. Filtreer vervolgens de gepoolde aplastische wasvloeistof door een spuitfilter van 0,22 micrometer in een tube van 15 milliliter die op ijs is geplaatst.

Bereid of koop een minigel met 10 of 15% polyacrylamide en zeven molaire ureum in trisborinezuur EDTA-buffer, met behulp van een acrylamide en bis-oplossing. Meng vervolgens de RNA-monsters met tweemaal denaturerende laadbuffer. Verwarm het mengsel vijf minuten op 65 graden Celsius en leg het direct op ijs.

Los nu de RNA-monsters op in 0.5 keer TBE lopende buffer bij kamertemperatuur door 220 volt toe te passen gedurende ongeveer een uur en 15 minuten. Kleur de gel vervolgens met cyber gold nucleïnezuurgelkleuring in 0,5 keer TBE gedurende 10 minuten. Spoel de gel twee keer af met gedestilleerd water en breng deze in beeld met behulp van een beeldvormingssysteem.

Om de opgeloste RNA-banden te kwantificeren, gebruikt u de gelanalysemethode uit de Afbeelding J-documentatie onder het menu Analyseren en gelanalyse. Bereid RNA-standaarden voor op twee technische replicaten door cellysaat-RNA te verdunnen in RNase- en DNase-vrij water. Om 1,5 keer cyber gold nucleïnezuurgelkleuring te bereiden, lost u deze op in 500 millimolaire tris HCL-buffer bij pH acht.

Voeg voor de opstelling van de microplaat 99 microliter gedestilleerd water toe aan elk putje. Voeg vervolgens een microliter RNA toe aan elk putje met hetzelfde volume voor zowel RNA-monsters als standaarden. Voeg ten slotte 50 microliter cybergoudoplossing toe aan elke put.

Om de parameters van de microplaatlezer in te stellen, kiest u voor lineair of orbitaal schudden gedurende drie seconden. Zet de microplaatlezer in de fluorescentie-eindpuntmodus met een excitatiegolflengte van 496 nanometer en een emissiegolflengte van 540 nanometer. Construeer een kalibratielijn met behulp van de fluorescentie-intensiteitswaarden van de RNA-standaarden.

Denaturering van RNA-gelanalyse toonde aan dat zowel monsters van bladoppervlakken als aplastische wasvloeistofmonsters een breed scala aan RNA-groottes bevatten, waaronder zowel lange als kleine RNA-soorten. De totale RNA-hoeveelheden geïsoleerd uit de aplastische wasvloeistof en het wassen van het bladoppervlak waren vergelijkbaar, wanneer ze werden genormaliseerd naar het verse gewicht van de plant. De RNA-profielen van bladoppervlakwas, aplastisch wassen en cellysaat verschillen aanzienlijk, wat minimale intracellulaire RNA-besmetting bevestigt en aantoont dat aplastisch RNA sterk wordt verwerkt met diffuse banden met een laag molecuulgewicht, toevoeging van 0,001% silhouet L-77 aan de blaasjesisolatiebuffer verdubbelde bijna de RNA-opbrengst van bladoppervlakken in vergelijking met de buffer zonder het bevochtigingsmiddel.

Maar het verhogen van deze concentratie tot 0,01% verbeterde het RNA-herstel niet verder. Een tweede wasbeurt van dezelfde bladeren herstelde ongeveer 63% van het RNA dat in de eerste wasbeurt was verkregen, wat wijst op voortdurende RNA-secretie op het bladoppervlak. RNA-kwantificering, met behulp van op fluorescentie gebaseerde microtiterplaattesten, toonde een hoge lineariteit met RNA-concentratie aan voor zowel cybergoud als RIBO 488-detectiemethoden.

We hebben aangetoond dat tRNA en van tRNA afgeleide fragmenten, of TDR's, vooral overvloedig aanwezig zijn in extracellulair RNA, waarschijnlijk vanwege hun weerstand tegen degradatie. We zijn dus van mening dat deze TDR's waarschijnlijk de genexpressie in bacteriën reguleren. We willen de cellulaire bronnen van RNA van het bladoppervlak identificeren en de biologische rol die dit RNase van het bladoppervlak zou kunnen spelen in de context van geplande microbe-interacties.