Meting van cyclisch guanosinemonofosfaat (cGMP) in vaste weefsels met behulp van Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Dechter Laboratory doet onderzoek naar het metabolisme van stikstofmonoxide. Stikstofmonoxide stimuleert de cyclische GMP-vorming via een adaptieve homeostasecascade. We streven ernaar om te leren hoe veroudering, voeding en andere factoren deze cascade beïnvloeden. Eerder onderzoek richt zich op de vorming van stikstofmonoxide en de daaruit voortvloeiende fysiologische effecten op het verwaarlozen van de cascade die de twee verbindt. Ons protocol meet cyclische GMP, een tweede boodschapper in de cascade. Ons protocol is eenvoudig, toegankelijk en gemakkelijk aan te passen aan verschillende weefseltypes.

[Verteller] Om te beginnen,

Plaats een tissue vergruizer, een pincet en lepel gedurende 10 minuten op droogijs. Weeg een teveel aan varkensweefsel af om rekening te houden met verlies tijdens verpulvering. Breng het weefsel over naar de gekoelde vergruizer die op droogijs is geplaatst. Bevries het weefsel snel door vloeibare stikstof in de vergruizer te gieten en laat het volledig verdampen voordat u verder gaat. Plaats vervolgens het deksel van de vergruizer terug en sla er 15 keer op met een hamer. Tarra nu een kralenhomogenisatorbuis op een balans. Breng met de gekoelde lepel en het pincet het verpulverde weefsel over in de buis. Pipetteer 0,1 normaal zoutzuur in de homogenisatiebuis en zorg ervoor dat het volume in microliters een veelvoud is van de weefselmassa in milligrammen. Homogeniseer vervolgens het weefselmonster met behulp van een homogenisator van een kralenmolen. Centrifugeer het homogenaat gedurende 30 minuten bij 17.000 g, terwijl u een monstertemperatuur van vier graden Celsius aanhoudt. Breng het resulterende supernatans over in een microcentrifugebuis. Centrifugeer opnieuw gedurende 10 minuten, terwijl u een monstertemperatuur van vier graden Celsius aanhoudt. Pipetteer een aliquot van het uiteindelijke bovenstaande in een microcentrifugebuis en plaats deze op ijs. Piket vervolgens 9,9 milliliter ELISA-buffer in een buis met het label Standaard B. Pipetteer 100 microliter standaard stockoplossing in de standaard B-buis. Vortex grondig om een gelijkmatige suspensie te garanderen. Breng 1.000 microliter van de oplossing over van standaard B naar de buis met het label standaard 1. Voeg vervolgens 500 microliter ELISA-buffer toe aan de buizen met het label Standaard 0 en Normen 2 tot en met 8. Vortex Standaard 1. Breng vervolgens 500 microliter van de oplossing over in standaard 2. Draai vervolgens standaard 2 en breng 500 microliter van de oplossing over in standaard 3. Ga door met het overbrengen van 500 microliter van elke vorige standaard naar de volgende, en draai grondig na elke editie totdat Standard 8 is voorbereid. Voeg voor de acetylering van de monsters 50 microliter kaliumhydroxide met vier molaria toe aan een monster van 250 microliter. Voeg onmiddellijk 12,5 microliter azijnzuuranhydride toe. Draai de oplossing gedurende 15 seconden. Piket vervolgens 12,5 microliter van vier molaire kaliumhydroxide en vortex opnieuw. Voeg aan de buis met het label Standaard 0 100 microliter kaliumhydroxide van vier molariërs toe, onmiddellijk gevolgd door 25 microliter azijnzuuranhydride. Piket na het vortexen 25 microliter kaliumhydroxide met vier molaria in de buis en vortex kort. Herhaal de toevoegingen van kaliumhydroxide en azijnzuuranhydride, gevolgd door vortexing voor de overige standaarden, voeg een vooraf bepaalde verhouding van ELISA-buffer en geacetyleerd monster aliquoot toe aan een microcentrifugebuis. Vortex Standaard 0. Breng 50 microliter aliquots van standaard 0 over naar vijf putjes aangeduid als de NSB- en B-nulputjes van de ELISA-microtiterplaat. Voeg vervolgens 50 microliter ELISA-buffer toe aan de twee NSB-putjes met standaard 0. Voeg met behulp van een enkele pipetpunt 50 microliter aliquots van de standaarden 1 tot en met 8 toe in dubbele putjes, te beginnen met standaard 8 en vervolgens naar standaard 1. Vortex elk monster. Voeg vervolgens 50 microliter toe aan de juiste putjes in tweevoud of drievoud. Pipetteer nu 50 microliter acetylcholinesterasetracer naar alle putjes die zijn aangeduid als NSB, B niets, standaard en monster. Voeg 50 microliter antiserum toe aan elke B-norm, standaard en monster goed. Dek de ELISA-plaat af en incubeer gedurende 18 uur bij vier graden Celsius. Keer na de incubatie de ELISA-plaat om boven een afvalcontainer om de inhoud weg te gooien. Vul de putjes met wasbuffer met behulp van een wasfles. Schud zachtjes gedurende vijf seconden. Gooi vervolgens de wasbuffer weg en tik de resterende vloeistof eruit op een papieren handdoek. Breng nu het reagens van Ellman over naar een reservoir. Gebruik snel een meerkanaals pipet om 200 microliter Ellman's reagens toe te voegen aan de lege, NSB-, B-, niets-, TA-, standaard- en monsterputten. Voeg vijf microliter acetylcholinesterasetracer toe aan het tapputje. Bedek vervolgens de ELISA-plaat met Parafilm. Plaats het in een met licht beschermde container om 60 tot 90 minuten bij kamertemperatuur te incuberen met roeren. Verwijder de parafilm en lees de optische dichtheid af bij 412 nanometer De cyclische GMP-concentratie in de varkenslever in de controlegroep was ongeveer 0,0202 nanomol per gram weefsel. In de met nitraat behandelde groep nam de cyclische GMP-concentratie toe tot ongeveer 0,0364 nanomol per gram weefsel.