Ontwikkeling van een innovatief LED-gebaseerd verlichtingsapparaat voor in vitro toepassing van fotodynamische therapie met Rose Bengal

Het doel van ons onderzoek is het ontwikkelen van fundamentele en translationele projecten die gericht zijn op het karakteriseren van het effect van fotodynamische therapie bij de behandeling van kanker zonder effectieve therapeutische opties. De huidige experimentele uitdagingen zijn het ontwikkelen van de technologieën die nodig zijn voor de implementatie van fotodynamische therapie van in vitro tot klinische toepassing, inclusief nieuwe fotosensibilisatoren en nieuwe verlichtingsapparatuur. In vergelijking met andere technieken omvat ons protocol een goedkoop en zelfgemaakt apparaat, waardoor een royalere verlichting van een plaat met 96 putjes en de fysiologische toestand in een celkweekincubator mogelijk is.

Verwijder om te beginnen de gekweekte HepG2-cellen uit de broedmachine en plaats de kolf onder het vooraf gereinigde microbiologische veiligheidsstation. Verwijder met een pipet het voedingsmedium uit de kweekkolf. Om reststof te verwijderen, spoelt u tijdens het voorzichtig mengen af met een fosfaatbuffer en verwijdert u vervolgens voorzichtig de buffer.

Breng vervolgens drie milliliter trypsineoplossing met 0,25% trypsine en 0,53 millimolaire EDTA aan op de cellen en plaats de cultuur vijf minuten terug in de broedmachine bij 37 graden Celsius om de cellen los te maken. Voeg na vijf minuten zeven milliliter kweekmedium toe aan de kolf om de trypsine te neutraliseren en de cellen in suspenis te brengen. Breng nu de trypsine, het medium en de losgemaakte cellen over in een centrifugebuis van 15 milliliter.

Om de cellen te tellen, pipetteert u 20 microliter van de celoplossing in een schone buis en voegt u 20 microliter trypanblauwe oplossing toe. Laad het bevlekte mengsel na het mengen op de teldia en plaats het in de cellenteller. Voeg vervolgens kweekmedium toe aan een buis en introduceer vervolgens cellen om een uiteindelijke concentratie van 150.000 cellen per milliliter te bereiken.

Zaad 1,5 keer 10 tot de macht van vier cellen per putje in een witte plaat met 96 putjes en een heldere, platte bodem. Bereid twee platen voor voor elke leestijd van de levensvatbaarheid. Incubeer de platen 24 uur voor de behandeling om de cellen te laten hechten.

Om een voorraadoplossing van bengaalse roos te bereiden, lost u deze op in een zoutoplossing van 10%. Verdun de rose bengaalse behandelingsoplossingen in concentraties variërend van nul tot 100 micromolair in celkweekmedium. Verwijder nu het kweekmedium van de celplaten en voeg 100 microliter van de bereide rozenbengaalse behandelingsoplossingen toe aan elk putje.

Incubeer de cellen gedurende twee uur met bengaalse roos om internalisatie mogelijk te maken. Verwijder na twee uur de bengaalse rozenoplossing uit elk putje, was de cellen twee keer met PBS, zuig de PBS op en voeg 100 microliter per putje bengaals vrij kweekmedium toe. Bedek de microplaten met aluminiumfolie om ze tegen licht te beschermen en zet de helft van de platen opzij voor verlichting tijdens de fotodynamische therapietest.

Sluit de mannelijke connector op de lichtverdeler aan op de vrouwelijke connector van de lichtbron. Verwijder de microplaten voor fotodynamische therapie en donkere toestand uit de couveuse. Pak de fotodynamische therapieplaat uit.

Zet vervolgens de dimmer op de LED-driver op het maximale niveau om een gemiddelde instraling van 0,62 milliwatt per vierkante centimeter over de 96 putjes te leveren. Plaats daarna de plaat op de lichtverdeler. Verlicht de microtiterplaat totdat de gewenste lichtdosis op de cellen is bereikt.

Zodra de gewenste lichtdosis is bereikt, schakelt u het apparaat uit. Wikkel de microplaat voor fotodynamische therapie opnieuw in aluminiumfolie en plaats deze samen met de bedieningsplaat terug in de couveuse totdat de levensvatbaarheidstest is uitgevoerd. Na voltooiing van de fotodynamische therapietest plaatst u de verlichte plaat gedurende 24 uur in de couveuse om een cellulaire respons na de behandeling mogelijk te maken.

Haal na de incubatietijd één verlichte en één niet-verlichte plaat op. Voeg 100 microliter reagens uit de cellevensvatbaarheidstestkit toe aan elk putje om het mitochondriale metabolisme en de ATP-productie te meten. Incubeer de platen 10 minuten in het donker voordat u verder gaat met de luminescentiemeting.

Lees na 10 minuten de luminescentie in elk putje af met behulp van een multimodale lezer. Beschouw de luminescentie van de onbehandelde controleputjes als 100% levensvatbaarheid. Normaliseer de luminescentiewaarden van de behandelde putten naar deze controle om het percentage levensvatbaarheid voor elke behandelingstoestand te berekenen.

Herhaal hetzelfde protocol voor het meten van de levensvatbaarheid van cellen op extra tijdstippen na de behandeling, zoals 24 uur, 48 uur en 72 uur. Verlichting alleen zonder bengaalse roos veranderde de levensvatbaarheid van HepG2-cellen bij geen van de geteste lichtdoses, en bengaalse roos alleen zonder licht veroorzaakte ook geen significante verandering in alle concentraties. Rose Bengaalse gemedieerde fotodynamische therapie met behulp van CELL-LED-550/3 verminderde de levensvatbaarheid van HepG2-cellen bij alle lichtdoses aanzienlijk, wat een sterk cytotoxisch effect vertoonde.

De overlap tussen het LED-emissieprofiel en het absorptiespectrum van bengaalse rose bevestigde de spectrale compatibiliteit van het CELL-LED-550/3-apparaat met de fotosensibilisator. In de toekomst is een van onze belangrijkste doelstellingen het ontwikkelen van nieuwe PDT-pakketten, die elk zowel een lichtgevoelige verbinding bevatten die specifieke kankercellen kan targeten als een bijbehorend verlichtingsapparaat.