Modellering van persistente Pseudomonas aeruginosa-infectie bij gewonde zebravislarven

Chronische infectie veroorzaakt door de bacterie Pseudomonas aeruginosa is tolerant voor antibiotica en zeer moeilijk te behandelen. Ons doel is om een in vivo model te ontwikkelen dat de ontdekking van efficiënte therapieën zal versnellen. Antibacteriële geneesmiddelen worden meestal in vitro gescreend en het testen van medicijnen bij chronisch geïnfecteerde muizen is een complexe uitdaging. Om de kloof tussen deze twee benaderingen op te vullen, stellen we een alternatief preklinisch model voor met behulp van gewonde zebravislarven. Ons model van persistente infectie bij zebravissen, gebaseerd op het gebruik van de klinische stam van Pseudomonas aeruginosa, reproduceert antibioticatolerantie. Terwijl micro-injectie vaak wordt gebruikt om zebravislarven te infecteren, weerspiegelt onze verwondingsmethode een natuurlijke infectiemodus en is zeer geschikt voor het screenen van therapeutische verbindingen.

[Verteller] Plaats om te beginnen naalden van 25 gauge op twee eetstokjes om het hanteren te vergemakkelijken. Identificeer en verwijder met behulp van een stereomicroscoop embryo's die een abnormale ontwikkeling vertonen of niet levensvatbaar zijn. Beweeg de schaal in een cirkelvormige beweging om de resterende embryo's in het midden te verzamelen. Gebruik nu twee verticaal georiënteerde naalden om elk embryo te isoleren, waarbij u de linkernaald bij de staart plaatst om het lichaam recht te houden. Maak met de juiste naald een enkele snede aan de rand van het notochord om de vin te verwijderen. Voltooi elke snede snel en zorg ervoor dat alle embryo's binnen 10 minuten worden ondergedompeld in een bacteriële oplossing. Voor de infectieprocedure vortex de Pseudomonas aeruginosa-oplossing onder een biologische veiligheidskast van type twee en voeg deze ongeveer één keer 10 toe aan de macht van zeven kolonievormende eenheden per milliliter aan een plaat met zes putjes. Gebruik een glazen pasteurpipet voor eenmalig gebruik om de gewonde embryo's te verzamelen en breng ze over in de bacteriële oplossing. Incubeer de plaat met zes putjes gedurende 1,5 uur bij 28 graden Celsius. Haal na de incubatie de geïnfecteerde embryo's op en plaats ze onder de microbiologische veiligheid om te wassen. Breng nu de embryo's met een glazen pipet over in 10 milliliter viswater zonder methyleenblauw, minimaliseer het overgedragen volume en broed gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Breng de embryo's vervolgens opnieuw met een glazen pipet over in vier milliliter viswater zonder methyleenblauw en broed kort in. Breng vervolgens met een pipet de geïnfecteerde embryo's afzonderlijk over in een plaat met 24 putjes en voeg een milliliter viswater zonder methyleenblauw toe aan elk putje. Plaats de plaat met 24 putjes in een broedmachine op 28 graden Celsius. Bereid microcentrifugebuisjes van 1,5 milliliter voor met 95 microliter 1X PBS voor elke geïnfecteerde larve. Breng de larven over in een plaat met zes putjes met vier milliliter viswater zonder methyleenblauw om planktonbacteriën te wassen en te verwijderen. Plaats elk gewassen embryo in een microcentrifugebuis met PBS en breng zo min mogelijk vloeistof over. Gebruik nu een stamper om elk embryo tegen de zijkant van de microcentrifugebuis te pletten, zodat de stamper daarna in de buis blijft. Til vervolgens de stamper op en voeg 100 microliter 2% PBS Triton toe om de resterende bacteriën van de stamper te spoelen, waardoor een uiteindelijke concentratie van 1% wordt bereikt. Draai de buis en broed gedurende 10 minuten. Doseer vervolgens drie druppels van 10 microliter onverdund lysaat van elk embryo op LB-agarplaten. Gebruik een meerkanaalspipet om elk lysaat in een plaat met 96 putjes tot een verdunning van 10 tot de macht min drie serieel te verdunnen. Doseer ten slotte drie druppels van 10 microliter van de verdunningen naast de onverdunde vlekken. En broed 's nachts uit bij 37 graden Celsius. Alle vier de cystische fibrose Pseudomonas aeruginosa-isolaten waren significant minder virulent in het gewonde embryomodel in vergelijking met de PAO1-referentiestam. In embryo's die besmet waren met twee isolaten, was de bacteriële belasting gedurende drie dagen duidelijk verminderd, wat wijst op bacteriële eliminatie. Daarentegen behielden de twee andere isolaten, B6513 en RP73, een relatief stabiele bacteriële belasting van 18 tot 65 uur na infectie na een eerste druppel, wat wijst op persistentie. Een korte behandeling van 30 minuten met tobramycine 1,5 uur na infectie verminderde de bacteriële belasting in embryo's die geïnfecteerd waren met isolaten B6513 drastisch. Tobramycine had geen significant effect op de bacteriële belasting wanneer het 24 of 48 uur na infectie werd toegediend, wat resistentie aantoonde tijdens aanhoudende infectiestadia.