Ookluc: een Plasmodium berghei-lijn voor het identificeren van transmissieblokkerende verbindingen

Ons onderzoek heeft tot doel transmissieblokkerende verbindingen en essentiële genen in de seksuele stadia van Plasmodium te identificeren en te karakteriseren met behulp van een high-throughput-systeem ter ondersteuning van nieuwe strategieën voor het onderbreken van de overdracht van malaria. Dit protocol pakt het gebrek aan gestandaardiseerde methoden met hoge doorvoer aan voor het identificeren van transmissieblokkerende verbindingen door gebruik te maken van een transgene P.berghei-lijn met geautomatiseerde detectie van parasieten na de bevruchting in de luminescentiefase. Dit protocol maakt de screening van seksuele stadia van Plasmodium mogelijk, detecteert vroege transmissieblokkerende verbindingen en ondersteunt nauwkeurige IC50-bepaling, wat voordelen biedt ten opzichte van conventionele methoden.

Bereid om te beginnen de samengestelde monsters voor door de samengestelde voorraad te verdunnen tot één millimolair met behulp van ookinete medium. Bereid de werkmonsters voor door deze koolzuurstok van één millimol te verdunnen in een verhouding van één op 100 om een uiteindelijke concentratie van 10 micromolair te bereiken. Bereid voor één test een eindvolume van 200 microliter werkmonster in tweevoud voor.

Als de verbinding is opgelost in een ander oplosmiddel dan water, maak dan een controlemonster door het oplosmiddel in het ookinete medium te verdunnen in dezelfde verhouding als voor het analysemonster. Plaats met behulp van twee platen met 96 putjes 80 microliter van elk monster in de daarvoor bestemde putjes voor positieve controle, negatieve controle, oplosmiddelcontrole en testmonsters in tweevoud volgens de gegeven lay-out. Voeg vier microliter geparasiteerd muizenbloed toe aan elk putje in een verhouding van één op 20, behalve de negatieve controleputjes.

Homogeniseer voorzichtig door op en neer te pipetteren. Voeg voor de negatieve controle niet-geïnfecteerd muizenbloed toe aan elk putje in een verhouding van één op 20 en homogeniseer voorzichtig door te pipetteren. Plaats de platen in een broedmachine die is ingesteld op 21 graden Celsius en broed gedurende zes uur of 24 uur.

Homogeniseer na de incubatie elk monster door op en neer te pipetteren om een goede menging van het bloedmedium te garanderen. Bereid het mengsel van lysisbuffer en luciferase-substraat direct voor gebruik in een verhouding van één op 50. Meng dit lysisbuffersubstraatmengsel met elk monster in een één-op-één-verhouding, zorg voor een zachte menging zonder bubbels te introduceren.

Incubeer de plaat gedurende drie tot vijf minuten bij 37 graden Celsius. Breng nu de monsters over naar een witte plaat met 96 putjes en meet de luminescentie met behulp van een plaatlezer. Noteer na de luminescentietest de ruwe luminescentiegegevens die door de plaatlezer worden weergegeven.

Bereken met behulp van een spreadsheet het gemiddelde van elke meting met behulp van de gegeven formule. Vervang XX door het adres van de eerste meetcel en YY door het adres van de tweede meetcel. Herhaal de formule voor alle monsters.

Zet de gegevens om in procentuele remming met behulp van de gegeven formule, waarbij A de eenheidswaarde van het relatieve licht van de steekproef is en B de relatieve lichteenheidswaarde van de controle. Selecteer verbindingen die meer dan 95% remming vertonen voor de bepaling van de remmende concentratie 50%. Na het infecteren van muizen met Ookluc en het verzamelen van geparasiteerd bloed, bereidt u samengestelde monsters voor met behulp van ookinete medium als verdunningsmiddel bij de beginconcentratie die 100% remming van de conversie vertoonde.

Pipetteer de monsters in drievoud in een plaat met 96 putjes volgens de gespecificeerde lay-out. Voer met behulp van een pipet tweevoudige seriële verdunningen uit door 80 microliter over te brengen van putje D1 naar D2, grondig te mengen, vervolgens 80 microliter over te brengen van D2 naar D3 en dit proces voort te zetten tot en met D12. Gooi de laatste 80 microliter uit D12 weg om 80 microliter per putje te behouden.

Voeg nu geparasiteerd muizenbloed toe aan elk putje in een verhouding van één op 20 en homogeniseer voorzichtig door te pipetteren. Voeg in de negatieve controleputjes niet-geïnfecteerd muizenbloed toe in een verhouding van één op 20 en homogeniseer voorzichtig. Plaats de plaat in een broedmachine die is ingesteld op 21 graden Celsius en incubeer zes of 24 uur voordat u de luminescentietest uitvoert.

Na het berekenen van de procentuele remming, opent u de analysesoftware en maakt u een XY-tabel om te plotten. Stel de y-as in om drie gerepliceerde waarden in te voeren in subkolommen naast elkaar. Plak de gegevens in de tabel, waarbij x staat voor de concentratie van de verbinding en y voor de procentuele remming.

Klik nu op Analyseren. Selecteer Niet-lineaire regressie, curve-aanpassing, kies vervolgens Dosis-responscurves, Remming, gevolgd door Remmer versus genormaliseerde respons, variabele helling en klik op OK. Bekijk de dosis-responscurve in het linkerdeelvenster en pas aanpassingen toe, zoals wijzigingen in de kleur- of puntnotatie.

Zoek de niet-lineaire fit-tabel om het berekende IC50- en 95%-betrouwbaarheidsinterval te vinden. Pyrimidine azepine 90 vertoonde een duidelijke concentratieafhankelijke remming van de doelactiviteit met een remming van meer dan 95% waargenomen bij concentraties van 0,125 tot één micromolair, en volledig verlies van activiteit onder 0,007 micromolair, wat wijst op een scherp drempeleffect in de remmende respons. De dosis-responscurve die op de pyrimidine azepine 90-gegevens werd gemonteerd, leverde een IC50-waarde op van 0,013 micromolair, wat wijst op een hoge potentie bij het remmen van de beoogde activiteit.