Snelle dissectie en dissociatie van het reukepitheel van de muis voor suspensies met één kern
1 augustus 2025
Dit artikel biedt een gestroomlijnd protocol voor de dissectie en dissociatie van muizen olfactorisch epitheel met het oog op single-nucleus RNA-sequencing.
Hier bieden we een protocol dat is ontworpen om te helpen bij de snelle dissectie van het olfactorische epitheel met het oog op sequencing van één cel of enkele kern. Ons protocol geeft prioriteit aan snelheid en leergemak, en het is ideaal voor toepassingen met één cel waarbij het weefsel wordt gehomogeniseerd en snelle dissectie belangrijker is dan het behoud van de anatomische integriteit, in tegenstelling tot eerdere methoden. Ons protocol maakt een snelle, gebruiksvriendelijke dissectie van het reukepitheel mogelijk, met als doel sequentieonderzoek naar enkelvoudige cellen te vergemakkelijken en onderzoek naar de genetische basis van het reuksysteem te bevorderen.
Zorg om te beginnen voor de ontvelde kop van een muis. Gebruik een fijne schaar met scherpe punt om twee incisies te maken om de jukbeenbogen van het squamosale bot bilateraal te breken door een schaarpunt in de achterste oogkas te plaatsen en de andere naast de gehoorgang. Maak een ondiepe incisie van baan tot baan langs het meest voorste aspect van het frontale bot, waarbij alleen het dorsale oppervlak van het frontale bot wordt ingesneden tot een diepte van ongeveer één tot twee millimeter.
Snijd nu langs de middellijn van de schedel vanaf het foramen magnum door de sagittale en interfrontale hechtingen tot aan de eerder gemaakte interorbitale incisie. Steek een tang in de incisie in de middellijn en trek een halve bol van het schedelgewelf stevig zijwaarts aan. Terwijl u het neusbot en de snijtanden vasthoudt, gebruikt u een tang om het contralaterale schedelgewelf te doorbreken.
Laat de hersenen, inclusief de bulbus olfactorius, worden verwijderd met de halve bol van het bot terwijl deze wordt weggescheurd. Gebruik vervolgens een bottang of Rongeurs om het resterende voorhoofdsbeen en premaxillair bot tot aan de basis van de snijtanden te verwijderen. Snijd langs de frontonasale hechting met een bottang om het neusbot los te maken van de cribriforme plaat.
Gebruik vervolgens een tang om het neusbot van de cribriforme plaat te tillen om het reukepitheel bloot te leggen. Als het resterende premaxillaire bot het dorsale reukepitheel blokkeert, verwijder dit dan voordat u verder gaat. Gebruik nu een tang met fijne punt om het dorsale aspect van het neustussenschot voorzichtig vast te zetten op de kruising met de cribriforme plaat en trek het naar achteren.
Het belangrijkste olfactorische epitheel zal loskomen als een volledig intacte structuur. Beeldvorming van flowcytometrie wees uit dat 53,69% van alle gebeurtenissen kernen waren. Van de afzonderlijke kernen had 53,89% een hoge circulariteit.
Kwaliteitscontroleplots bevestigden een consistente sequentiekwaliteit over vier monsters, met uniforme gen- en mitochondriale tellingsverdelingen. De markergenen van de dataset zijn consistent met veel van de gevestigde markergenen voor elk celtype.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor de snelle dissectie en dissociatie van het muis olfactory epithelium, bedoeld om single-nucleus RNA-sequencing te faciliteren. De methode geeft prioriteit aan snelheid en gebruiksgemak, waardoor deze geschikt is voor toepassingen waarbij weefselhomogenisatie noodzakelijk is.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Genomica
- Onderzoek naar het reukstelsel
Achtergrond
- RNA-sequencing op single-cell- en single-nucleus-niveau is cruciaal voor het begrijpen van cellulaire diversiteit.
- Eerdere dissectiemethoden legden de nadruk op anatomische integriteit, wat mogelijk niet ideaal is voor bepaalde toepassingen.
- Het reukepitheel speelt een fundamentele rol bij de olfactorische sensorische transductie.
- Het verbeteren van dissectietechnieken kan de efficiëntie van genetische studies met betrekking tot reuk vermeerderen.
Doel van de studie
- Om een gebruiksvriendelijk protocol te bieden voor de dissectie van het reukepitheel.
- Om snelle weefselverwerking te faciliteren voor onderzoek met single-cell sequencing.
- Om onderzoek naar de genetische mechanismen van het reuksysteem te bevorderen.
Gebruikte methoden
- De methode maakt gebruik van dissectie van het reukepitheel uit muismodellen.
- Dit biologische model omvat het reukstelsel van de muis, waarbij de nadruk ligt op de noodzaak van een snelle extractie.
- Het verwijderen van het bot en zorgvuldige manipulatie waarborgen de integriteit van het belangrijkste reukepitheel.
- De belangrijkste stappen omvatten incisies in het schedeldak en de extractie van de reukstructuren.
- Er zijn kwaliteitscontroles geïmplementeerd om een consistente sequentiekwaliteit te behouden.
Belangrijkste resultaten
- Meer dan de helft van de verzamelde events werden geïdentificeerd als kernen, wat duidt op een succesvolle isolatie.
- De hoge circulariteit van de kernen suggereert een goede kwaliteitsbehoud tijdens de dissectie.
- Kwaliteitscontrole toonde uniforme distributies van genen en mitochondria aan.
- Markergenen kwamen overeen met vastgestelde benchmarks voor celtypen.
Conclusies
- De studie presenteert een snelle methodologische vooruitgang voor het dissecteren van het reukepitheel.
- Door efficiënte single-nucleus sequencing mogelijk te maken, draagt het bij aan het begrijpen van genetische factoren bij reukwaarneming.
- Dit protocol kan de analyse van neuronale mechanismen en plasticiteit in sensorische systemen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Snelle en reproduceerbare bereiding van enkelkern-suspensies uit het olfactory epithelium van de muis maakt moleculaire profilering met een hoge resolutie mogelijk van diverse neuronale populaties en progenitorpopulaties. Dit protocol pakt een belangrijk knelpunt in single-cell genomics aan door de tijd voor weefselextractie te minimaliseren en de nucleaire integriteit te behouden, wat robuuste targetvalidatie en mechanistische risicoreductie ondersteunt in sensory neuroscience-pipelines. De aanpak verhoogt het voorspellend vertrouwen voor vroege discovery en translationeel onderzoek gericht op de genetische basis van olfactorische functie en regeneratie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt snelle hypothese-testen van genexpressie in olfactorische sensorische neuronen en progenitoren mogelijk.
- Ondersteunt functionele target-validatie door de nucleaire kwaliteit te behouden voor downstream sequencing.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie van kandidaat-paden die betrokken zijn bij de turnover van sensorische neuronen.
- Verbetert het voorspellende vertrouwen bij het prioriteren van targets in onderzoek naar het sensorische systeem.
Screening & assayontwikkeling
- Levert hoogwaardige single-nucleus suspensies die geschikt zijn voor gestandaardiseerde workflows voor single-cell sequencing.
- Garandeert reproduceerbaarheid en schaalbaarheid over meerdere monsters en experimentele runs.
- Levert kwantitatieve resultaten, waaronder nucleaire opbrengst en kwaliteitsmetrieken, voor benchmarking van assays.
- Maakt een betrouwbare evaluatie mogelijk van veranderingen in genexpressie als reactie op experimentele perturbaties.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelateerde modellen voor het bestuderen van olfactorische dysfunctie en regeneratie.
- Ondersteunt de continuïteit van genomics in de ontdekkingsfase tot preklinische validatie van moleculaire targets.
- Vermindert het biologische risico door consistente, hoogwaardige gegevens te leveren voor de identificatie van translationele biomarkers.
- Faciliteert risico-gecorrigeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling binnen portfolio's van sensorische neurowetenschappen.
Pipeline- & Workflowintegratie
Dit protocol integreert op het grensvlak van vroege ontdekking en lead-identificatie, waardoor een naadloze overgang mogelijk is van weefselextractie naar single-nucleus sequencing en downstream analyses.
- Ontdekkingsbiologie: Versnelt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden in onderzoek naar het olfactorische systeem.
- Screening: Levert assay-klare kernsuspensies met gevalideerde kwaliteitsmetrieken.
- Analytica: Biedt kwantitatieve uitslagen voor het vergelijken van genexpressie tussen celtypen en condities.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt de afstemming van biomarkers en de ontwikkeling van preklinische modellen voor olfactorische stoornissen.
- Herbruikbaarheid op bedrijfsniveau: Vestigt een gestandaardiseerde, herbruikbare workflow voor de preparatie van enkelvoudige kernen in sensorische weefsels.
Operationele & Bedrijfsmatige Impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en doorvoersnelheid voor single-cell genomics.
- Strategische waarde: Maakt geïnformeerde go/no-go beslissingen en kapitaalefficiënt portfoliobeheer mogelijk.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en het vorderen van programma's in de sensorische neurowetenschap.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist technische expertise in snelle dissectie en nucleaire isolatie uit complexe anatomische structuren.
- Vereist toegang tot gespecialiseerde instrumentatie voor weefselverwerking en kwaliteitscontrole (bijv. imaging flowcytometrie).
- Maakt standaardisatie tussen teams noodzakelijk om reproduceerbaarheid tussen studies en operators te waarborgen.
- Kan aanpassing vereisen voor gebruik met andere weefseltypen of modelsystemen met afwijkende anatomische kenmerken.
- Extractie gericht op snelheid kan toepassingen beperken waarbij anatomische integriteit kritiek is.
