Beeldgeleide in vivo tracking van getransplanteerde distale longepitheliale voorlopercellen voor longfibrose met behulp van magnetische beeldvorming

Deze studie richt zich op het intratracheale intubatieprotocol als een cruciale toedieningsmethode voor longceltherapie, met als doel celtransplantatie en niet-invasieve tracking te optimaliseren met behulp van magnetische deeltjesbeeldvorming bij pulmonale fibrose. Ons protocol pakt het gebrek aan niet-invasieve methoden aan voor in vivo tracking van celtherapie bij pulmonale fibrose door intratracheale isolatie te combineren met magnetische deeltjesbeeldvorming om celverdeling te monitoren. Ons protocol biedt precieze, gelokaliseerde cellevering via intratracheale installatie en superieure tracking met behulp van magnetische deeltjesbeeldvorming, wat zorgt voor een hoge gevoeligheid en realtime beeldvorming zonder achtergrondgeluid.

Om te beginnen weeg je een 12 weken oude mannelijke NOD- of SCID-muis om de benodigde dosis bleomycine te berekenen. Bereid de bleomycineoplossing in steriele zoutoplossing op de gewenste concentratie tot een eindvolume van 50 microliter in een microcentrifugebuis van 1,7 milliliter. Vervolgens laad je de oplossing in een pipet.

Laad een spuit vooraf met 200 microliter lucht om ervoor te zorgen dat het volledige vloeistofvolume tijdens het injecteren in de luchtpijp wordt gepompt. Na het verdoofen van de muis assembleer je de vezellichtintubatiekit met de optische vezelprobe die door de laryngoscoop en katheter wordt gevoerd. Knijp in de teen van het dier om voldoende verdoving te controleren en breng oogzalf aan op beide ogen telkens wanneer het dier onder narcose is.

Hang de muis aan de snijtanden in rugligging op een schuine intubatiestandaard voor knaagdieren. Met een stompe tang pak je de tong en beweeg je hem voorzichtig omhoog en naar links om het strottenhoofd bloot te leggen voor een duidelijke zichtbaarheid. Zet de glasvezelsonde aan en leid deze naar de mond om de luchtpijp te benaderen.

Gebruik de vergrootglas van de laryngoscoop om het zicht te verbeteren en de stembanden bij de tracheale opening te identificeren. Plaats de katheter in de luchtpijpopening en verwijder voorzichtig de laryngoscoop. Plaats vervolgens een druppel zoutoplossing van 20 microliter aan het bovenste uiteinde van de katheter.

Bevestig de voorgeladen spuit met 200 microliter lucht en duw de druppel in de luchtpijp. Vul vervolgens de katheter met maximaal 50 microliter bleomycine en geef het met de luchtgevulde spuit. Houd de katheter 5-7 seconden op zijn plaats om terugstroming van de vloeistof uit de luchtpijp te voorkomen.

Verwijder dan voorzichtig de katheter. Houd de muis minstens 30 seconden op de intubatiestandaard in dezelfde positie. Haal dan de muis van de standaard en plaats hem in een herstelkooi op een warmtemat.

Houd de muis continu in de gaten totdat hij volledig hersteld is van de narcose. Verkrijg nanodeeltjes-gelabelde menselijke luchtwegepitelcellen van patiënten met idiopathische longfibrose. 72 uur na de installatie van bleomycine wordt de muis opnieuw verdoofd en de intratracheale installatieprocedure herhaald om 50.000 cellen in 50 microliter celsuspensie toe te dienen.

Laat de muis minstens 20 minuten herstellen voordat er magnetische deeltjesbeeldvorming plaatsvindt. Zet het muisbed in de magnetische deeltjesscanner nadat je de anesthesielijn onder het bed door de juiste connectoren hebt gehaald. Terwijl de muis wordt verdoofd, bereid je de magnetische deeltjesbeeldscanner voor.

Na het bevestigen van voldoende verdoving met een test voor een teenknijptest, plaats je de muis voorzichtig op het magnetische deeltjesbeeldvormingsbed. Duw het bed met de muis in de scanner en klik op Start Scan in de software-interface om de beeldvorming te starten. Na de scan haal je de muis uit het magnetische deeltjesbeeldbed en plaats je hem in een herstelkooi die op een warmtekussen staat.

Analyseer tenslotte de verkregen beelden met behulp van beeldanalysesoftware. De 2D-magnetische deeltjesbeeldvorming, of MPI-signaalintensiteit, nam evenredig toe met de concentratie van de ijzeroxidetracer over alle geteste celtellingen. Een concentratie van 250 microgram per milliliter werd gekozen als de optimale labelconcentratie.

Fluorescentiemicroscopie bevestigde succesvolle in vitro-labeling van cellen, met rode dextransignalen in het cytoplasma en blauw DAPI-gekleurde kernen. De signaalintensiteiten in 2D MPI-beelden namen toe met het aantal gelabelde cellen, wat een positieve correlatie tussen signaal en celaantal bevestigde. Op basis hiervan werden 50.000 cellen geselecteerd voor transplantatie.

Het beeld van de controle van de lege bed toonde geen achtergrondsignaal van MPI, wat de specificiteit van de scanner ten opzichte van gelabelde cellen bevestigde. De vier waargenomen signalen komen overeen met fiduciale markeringen die als bediening worden gebruikt. Succesvolle transplantatie van gelabelde cellen in de longen produceerde een duidelijk vlindervormig MPI-signaal met zichtbare verspreiding in beide longen, wat effectieve intratracheale levering bevestigde.

Onvolledige celinstallatie leidde tot signaal in zowel de longen als het nekgebied, wat wijst op lekkage door vroegtijdige katheterverwijdering. Het verkeerd plaatsen van de katheter in de slokdarm in plaats van de luchtpijp zorgde ervoor dat het MPI-signaal lager in de buik verscheen, wat wijst op afzetting van cellen in de maag. 14 dagen na transplantatie bevestigde ex vivo beeldvorming van de verwijderde longen het voortbestaan van gelabelde cellen.

Onze bevindingen zullen de diagnostische nauwkeurigheid verbeteren en de ontwikkeling van gerichte therapieën voor longziekten mogelijk maken, waaronder stamceltherapie, en de vooruitgang en innovatie in longbeeldvorming en aanverwante biomedische vakgebieden versnellen. Ons laboratorium zal zich richten op het versterken van stamcelgebaseerde therapieën voor longfibrose, waarbij niet-invasieve beeldvormingstechnieken worden verbeterd, met als doel de celafgifte te optimaliseren en de therapeutische effectiviteit van pulmonale fibrose te monitoren.