Kwantificering van violaceïne in Chromobacterium violaceum en de remming ervan door bioactieve stoffen

Ons onderzoek is gericht op het identificeren van verbindingen die quorum sensing remmen, die de belangrijkste fenotypes reguleert. Dit protocol screent moleculen die de productie van violaceïne verminderen zonder de bacteriegroei te beïnvloeden, wat suggereert dat quorum sensing interferentie is. Recente studies hebben nieuwe bioactieve stoffen geïdentificeerd die quorum sensing remmen zonder de bacteriegroei te beïnvloeden, waardoor hun potentieel als antivirulentiemiddel tegen antibioticaresistente bacteriën wordt versterkt.

De belangrijkste uitdagingen zijn onder meer de specificiteit van quorum sensing-remming, aangezien verbindingen de groei of de eigenschappen kunnen beïnvloeden. In dit protocol dat eerbied en oplosbaarheid wordt genoemd, vereist kwantificering van impactbalancering een zorgvuldige behandeling. We hebben een protocol opgesteld dat wordt gebruikt in bioactieve stoffen in subremmende concentraties die de bacteriegroei niet beïnvloeden.

Dit is een belangrijk uitgangspunt voor het starten van quorum sensing-signalering die verschilt van antimicrobieel onderzoek. We zullen ons richten op het identificeren van nieuwe quorumtoestandremmers en opgehelderde remmingsmechanismen van communicatie, vooral in bacteriën die relevant zijn voor voedsel en gezondheid. Kweek om te beginnen een cultuur van vijf milliliter chromobacterium violaceum ATCC 12472 in Luria Bertani of LB-bouillon.

Incubeer de cultuur bij 30 graden Celsius in een schudbroedmachine met een snelheid van 220 omwentelingen per minuut gedurende 24 uur. Meet de optische dichtheid van de nachtcultuur en stel deze in op ongeveer één keer 10 tot de macht van acht kolonievormende eenheden per milliliter. Met behulp van de LB-bouillon.

Weeg voor de bereiding van de verbinding de bioactieve stof en verdun deze in pure DMSO of een één-op-één mengsel van DMSO en water, afhankelijk van de oplosbaarheid. Neem een plaat met 96 putjes met platte bodem en voeg LB-bouillon toe samen met de bioactieve stof volgens een serieel verdunningsschema. Om het vereiste volume voorraadoplossing voor de gewenste concentratie in elk putje te berekenen, past u de formule toe.

In de eerste kolom van elke reeks graanverdunningen. Voeg 196 microliter Luria Bertani-bouillon toe aan kolom drie, vijf en zeven. Voeg vervolgens in de volgende kolommen die voor de verdunning worden gebruikt, 100 microliter Luria Bertani-bouillon toe aan de kolommen vier, zes en acht.

Om de seriële verdunning te starten, voegt u vier microliter van de bioactieve stof toe aan het eerste putje van elke set, wat overeenkomt met kolommen drie, vijf en zeven. Breng na het mengen 100 microliter over van elke put naar de aangrenzende kolom. Om de seriële verdunning voort te zetten tot de kolommen vier, zes en acht.

Herhaal de hele procedure in drievoud voor elke concentratie van elke verbinding met behulp van verse tips om kruisbesmetting te voorkomen. Voeg 80 microliter Luria Bertani-bouillon toe aan de rijen B tot en met D in alle putjes. Dit brengt het totaal op 180 microliter per putje.

Voeg vervolgens 20 microliter van de gestandaardiseerde chromobacterium violaceum-cultuur van het vorige preparaat toe aan elk van die putjes, tot een eindvolume van 200 microliter. Gebaseerd op de compatibiliteit van de spectrofotometer. Bedek de microplaat met een deksel of afdichtingsfolie om verdamping te voorkomen.

Incubeer de afgesloten plaat bij 30 graden Celsius met agitatie met 130 omwentelingen per minuut gedurende 24 uur. Breng de plaat na incubatie over naar een droogbroedmachine op 60 graden Celsius. Verwijder het deksel en laat het ongeveer acht uur volledig drogen.

Eenmaal droog, verwijder je de plaat uit de broedmachine en voeg je 200 microliter pure DMSO toe aan elk putje. Dek de plaat af en incubeer deze bij 25 graden Celsius door gedurende 30 minuten met 130 omwentelingen per minuut te schudden om het violaceïnepigment op te lossen. Breng na de incubatie voorzichtig 100 microliter van de opgeloste violaceïneoplossing over op een nieuwe microplaat.

Vermijd contact tussen de pipetpunt en de wanden van de put. Meet de absorptie van violaceïne bij 595 nanometer in een microplaatspectrofotometer met het deksel erop om besmetting te voorkomen. Schud vijf seconden voor elke meting en voer de meting uit met het deksel erop om besmetting te voorkomen.

Om de productie van violaceïne te berekenen, trekt u eerst de absorptie van de blanco van elk monster af om achtergrondinterferentie uit te sluiten, en berekent u vervolgens het percentage violaceïne met behulp van de onbehandelde controle als referentie met de vergelijking. Drie bioactieve stoffen, resveratrol, farnesol en linalool werden getest op hun vermogen om de productie van violaceïne te remmen in chromobacterium violaceum ATCC 12472. Farnesol verminderde de productie van violaceïne aanzienlijk tot 9% bij 200 microgram per milliliter en tot 19% bij 100 microgram per milliliter, vergeleken met 100% bij de onbehandelde controle.

Linaloolbehandeling met zowel 200 als 100 microgram per milliliter resulteerde in een violaceïneproductie van 32%, wat een remming van 68% vertoonde ten opzichte van controle. Resveratrol bij 25 microgram per milliliter verminderde de productie van violaceïne tot 15%, terwijl het bij 12 microgram per milliliter 30% bereiktevergeleken met 100%bij de onbehandelde controle. Microplaatbeelden bevestigden visueel verminderde violaceïnepigmentatie voor alle behandelingen in vergelijking met de onbehandelde controle.