Gedragsanalyse van locomotorische disfunctie bij Drosophila melanogaster als uitlezing voor neurotoxiciteit

Het doel van ons onderzoek is het ontwikkelen van een kosteneffectieve en ethisch gunstige methode voor het screenen van neurotoxische stoffen. Traditionele methoden voor toxicologische tests zijn vaak gebaseerd op virtuele tariefmodellen, die dure, tijdrovende en anderszins ethische bezwaren zijn, zoals we weten. We wilden onderzoeken of we vroege tekenen van neurotoxiciteit konden detecteren met behulp van een alternatief model als een Drosophila melanogaster die zowel gevoelig als schaalbaar is. Dit protocol helpt ons om gedragsfenotypes te detecteren, zoals veranderingen in bewegingspatronen en hiperactiviteit, maar ook progressieve motorische achteruitgang of schriftelijke verstoringen van de beveiliging, en ook de brede voorkeur wordt getest.

Wat onze protocolvoordelen maakt, is dat het de klassieke klimtest combineert met een real-time monitoringtechnologie, en dit stelt ons in staat om subtiele motorische stoornissen vast te leggen die mogelijk over het hoofd worden gezien. Door traditionele methoden die een hogere gevoeligheid en nauwkeurigere gedragsgegevens bieden.

[Verteller] Breng om te beginnen de vliegen voorzichtig over naar een lege fles. Plaats de fles met de vliegen in een doos gevuld met ijs en zorg ervoor dat de hele fles bedekt is. Tik na een minuut zachtjes op de fles om te controleren of alle vliegen verdoofd zijn. Maak een kleinere bak gevuld met ijs klaar. Plaats een petrischaal of een plat schoon oppervlak op het ijs om een gekoeld platform te creëren. Keer nu de buis om over de gekoelde petrischaal en tik zachtjes om de vliegen op het koude oppervlak los te laten. Breng de vliegen voorzichtig over in lege flesjes. Laat de vliegen 30 minuten herstellen van de anesthesie in een gecontroleerde omgeving bij 25 graden Celsius met een licht-donkercyclus van 12 uur en een luchtvochtigheid van 50%. Gebruik vervolgens voor de bereiding van microcapillaire voeding een pipet om handmatig 10 microliter van de testoplossing in elke microcapillaire buis te laden, zodat een consistent volume over alle monsters wordt gegarandeerd. Voeg drie tot vijf microliter minerale olie toe aan het open uiteinde van elke microcapillaire buis om verdamping en lekkage tijdens het experiment te voorkomen. Steek de voorgevulde microcapillairen door de gaten in de pluggen van de katoenen injectieflacon en zorg ervoor dat ze goed vastzitten. Plaats de flesjes met vliegen in een broedmachine die is ingesteld op 25 graden Celsius met een licht-donkercyclus van 12 uur en laat de flesjes in de broedmachine staan voor de duur van het experiment. Breng de vliegen elke 12 uur over naar een schoon, leeg flesje om hun locomotorische activiteit te beoordelen. Meet en markeer de lijn zeven centimeter vanaf de bodem van de injectieflacon met behulp van een permanente marker. Deze markering zal dienen als klimdoel. Plaats een camera of telefoon op een stabiele locatie om het klimgedrag vast te leggen. Zorg voor de juiste verlichting en een transparante achtergrond voor een duidelijke zichtbaarheid en analyse. Controleer of de experimentele opstelling compatibel is met het gezichtsveld van de camera en begin met opnemen. Bekijk de video-opnamen en meet de tijd die elke vlieg nodig heeft om de zeven centimeter te bereiken. Bereid de voedingsmicrocapillairen voor met het monster en de afdichting van minerale olie zoals eerder getoond. Bereid vervolgens individuele voortbewegingskamers voor met behulp van doorzichtige plastic rietjes die tot een lengte van ongeveer zes centimeter zijn gesneden. Sluit het ene uiteinde van elk rietje af met een transparante folie om een luchtdichte afsluiting te creëren. Maak in de buurt van het afgesloten uiteinde van het rietje een klein gaatje om het voedingsmicrocapillair in te brengen, zodat het goed past en niet lekt of beweegt tijdens de test. Na het verdoven en scheiden van de vliegen, zoals eerder getoond, plaatst u voorzichtig een verdoofde vlieg in elk buisje met een fijne verfkwast. Sluit het open uiteinde van elke buis af met transparante folie of een katoenen plug, zodat er lucht kan stromen en ontsnappen wordt voorkomen. Steek nu een voorgevuld microcapillair in elke voorbereide kamer door het daarvoor bestemde gat. Plaats de geassembleerde buisjes in de testarena en zorg ervoor dat de microcapillairen toegankelijk blijven voor dagelijkse vervanging. Plaats de hele opstelling in een kamer die op 25 graden Celsius wordt gehouden met een licht-donkercyclus van 12 uur en een luchtvochtigheid van 50%. Sluit het apparaat aan op het lokale volgsysteem of netwerk. Ga naar het softwareplatform en zoek het apparaat dat aan het experiment is toegewezen. Zorg ervoor dat het systeem elke vlieg correct volgt op basis van visuele markeringen. Voer alle experimentele metadata in en begin met het opnemen van de test. Het klimvermogen beoordeeld met behulp van de negatieve geotaxistest na 24 en 48 uur vertoont vergelijkbare prestaties tussen de controle- en behandelingsgroepen na 24 uur, wat wijst op geen onmiddellijke motorische tekorten. Na 48 uur hebben behandelde vliegen bijna twee keer zo lang nodig om te klimmen in vergelijking met controles, wat wijst op aanzienlijke motorische stoornissen. Continu volgen van de activiteit laat zien dat behandelde vliegen aanvankelijk verhoogde beweging vertonen, maar dat hun activiteit na 12 uur sterk afneemt, wat wijst op vroege hyperexciteerbaarheid gevolgd door verminderde motorische functie. Tegen 24 tot 40 uur vertonen behandelde vliegen minder beweging in vergelijking met controles. Over het algemeen hebben de behandelde vliegen ongeveer 20% verminderde activiteit gedurende 40 uur. Behandelde vliegen reageerden aanvankelijk met een vertraging op de lichtsignalen, gevolgd door voorbijgaande circadiane uitlijning, maar verloren geleidelijk ritmiek met 48 uur, waarschijnlijk als gevolg van een tekort aan locomotieven. Behandelde vliegen geven meer de voorkeur aan lichte zones dan aan controles.