In vitro Reconstitutie van cytoskeletale netwerken in fasegescheiden gigantische unilamellaire blaasjes (GUV's)

Ons onderzoek onderzoekt of een minimale synthetische cel belangrijke biologische functies kan repliceren, waarbij we ons richten op het ontwerpen van membranen die de structuur en het gedrag van natuurlijke celmembranen nauwkeurig nabootsen.

Verschillende technologieën worden gebruikt om fasegescheiden blaasjes te maken en deze microdragers voor een verscheidenheid aan toepassingen te gebruiken. De technologieën zijn bijvoorbeeld dubbellaags cDICE en elektroformatie. Een grote uitdaging is het behoud van de eiwitfunctionaliteit en het genereren van fasescheiding op het membraanblaasje. Het verhogen van de temperatuur kan de eiwitten en andere biomoleculen destabiliseren.

[Verteller] Verkrijg om te beginnen flesjes met gebiotinyleerde en niet-gebiotinyleerde lipidenmengsels. Los 50 microliter van elk 32-millimolair lipidenmengsel op in chloroform. Droog ze vervolgens in twee glazen flesjes onder stikstofgasstroom gedurende ongeveer 15 minuten. Plaats de glazen flesjes in een exsiccatuur. Bewaar ze ongeveer 30 minuten onder vacuüm om eventuele resterende chloroform te verwijderen. Dispergeer nu de gedroogde lipidefilms in een mengsel van 20 microliter decaan en 500 microliter minerale olie in dezelfde flesjes om een uiteindelijke lipideconcentratie van 3,2 millimolair te bereiken. Gebruik een badsonicator om de twee mengsels gedurende 30 minuten op ongeveer 50 graden Celsius te sonificeren. Breng vervolgens de lipide- en oliemengsels over in twee tubes. Terwijl de mengsels aan het broeden zijn, bereid je de inwendige inkapselingsmix voor eiwitten voor. Om het FtsZ-eiwitmengsel te bereiden, voegt u de vermelde reagentia toe aan een eindvolume van 10 microliter in een buisje. Bewaar het mengsel op ijs tot gebruik. Voor de inkapseling van actinebundels bereidt u eerst 10 microliter van de actine Master Mix, die 86% G-actine, 10% ATTO 488 actine en 4% gebiotinyleerde actine in water bevat. Bewaar het mengsel op ijs en bescherm het tegen licht. Bereid vlak voor gebruik de uiteindelijke actine-oplossing voor door achtereenvolgens jodixanol, water, NeutrAvidin, BSA, Ficoll 70, 10x actinepolymerisatiebuffer, A-Mix, fascine en ATP toe te voegen. Meng goed en gebruik vijf microliter voor het inkapselen. Om FtsZ in te kapselen, pipetteert u 500 microliter FtsZ-reactiebuffer in een plastic buisje van 1,5 milliliter. Voeg voorzichtig 200 microliter lipide-en-oliemengsel toe om een olie-waterinterface te vormen. Voeg in een tweede tube 200 microliter lipide-en-oliemix toe. Incubeer deze buis gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Piket vervolgens vijf microliter van het FtsZ-eiwitmengsel in de geïncubeerde lipide-en-oliebuis, zodat deze als een druppel kan zinken. Tik vijf tot zes keer zachtjes op de buis, totdat de oplossing troebel wordt, om een emulsie te vormen. Piket deze emulsie voorzichtig op de eerder voorbereide olie-waterinterface. Centrifugeer het monster vervolgens gedurende 30 minuten bij 6.000 g bij 37 graden Celsius. Koel het monster gedurende 30 minuten af tot kamertemperatuur. Gebruik nu een pipet om de bovenste olielaag voorzichtig te verwijderen, zodat er 100 tot 200 microliter oplossing overblijft voor beeldvorming. Knip een pipetpunt schuin af. Gebruik het om 50 tot 100 microliter GUV-oplossing van de bodem van de buis te halen. Om actine direct in een plaat met 96 putjes in te kapselen, combineert u 198 microliter glucose met twee molaire glucose met 802 microliter water om een externe glucoseoplossing te bereiden die overeenkomt met de osmolariteit van het inwendige actinemengsel. Passiveer een putje van een plaat met 96 putjes door 100 microliter BSA van 10 gram per liter aan een putje toe te voegen. Was na een incubatie van 10 tot 15 minuten de put vijf keer met 100 microliter buitenoplossing. Laat 100 microliter van de laatste was over. Voeg nu voorzichtig 50 microliter lipide-en-oliemengsel toe aan het putje door de pipet op de zijwand te laten rusten om te zorgen voor de juiste gelaagdheid bovenop de buitenste oplossing. Voeg in een aparte buis 100 microliter lipide toe aan olie en incubeer. Voeg 2,5 microliter uiteindelijke actine-oplossing toe aan de geïncubeerde lipide-en-oliebuis, zodat deze als een druppel kan zinken. Tik 10 tot 20 keer zachtjes op de bodem van de buis, totdat het mengsel troebel wordt. Piket voorzichtig de emulsie in het midden van de oliemonolaag in de put, zonder de interface te verbreken. Centrifugeer vervolgens de plaat met 96 putjes bij 200 g gedurende 20 minuten bij 37 graden Celsius. Laat de plaat 30 minuten afkoelen tot kamertemperatuur voordat u het beeldt. Gigantische unilamellaire blaasjes, of GUV's, met membranen die waren gedemengd in vloeistof-ongeordende en vloeistofgeordende domeinen, en een hoge opbrengst van blaasjes met een grootte tussen vijf en 30 micrometer, werd verkregen. FtsZ-netwerken werden gerecapituleerd binnen de GUV's en bij voorkeur gelokaliseerd naar de vloeistofverstoorde membraandomeinen in aanwezigheid van GTP en Ficoll 70. Actinenetwerken verschenen, wanneer ze werden gereconstitueerd, als dunne bundels die zich aan het membraan hechtten en schaarse webachtige structuren vormden. Zonder gebiotinyleerde lipiden konden actinebundels zich niet aan het membraan hechten en bleven ze in plaats daarvan stijf en recht in het lumen van het blaasje. Onder hogere centrifugatieomstandigheden aggregeerden blaasjes met actine-myosine tot een opeengepakte weefselachtige architectuur in de productieput.