Real-time metabole detectie in levende cellen met behulp van gehyperpolariseerde ¹³C NMR

We hebben een niet-invasieve methode ontwikkeld om het real-time serummetabolisme te meten met behulp van geavanceerde hypergepolariseerde NMR-technieken. Ons doel is het creëren van toegankelijke tools voor verschillende biologische onderzoekstoepassingen. Er werden verschillende gehyperpolariseerde NMR-systemen voor serummetabolisme gerapporteerd. Tot nu toe waren er echter geen gestandaardiseerde en reproduceerbare protocollen voor een bredere onderzoeksimplementatie.

Ons protocol verbetert de toegankelijkheid met behulp van commercieel beschikbare componenten. We bieden ook uitgebreide validatie, inclusief voordelen voor systeemmenging en herhaalde meetmogelijkheden voor bredere aanpassing. Onze resultaten maken het mogelijk om dynamische metabolische veranderingen in levende cellen in real-time te volgen zonder afleiding. Dit opent nieuwe mogelijkheden voor langdurige geneesmiddelenstudies in diverse toepassingen van metabole sondes.

Onze aanpak heeft beperkingen, waaronder probleemopties en automatiseringsvereisten. Het oplossen van de uitdagingen zal cellulaire metabole meettechnieken ontwikkelen en de DNP-onderzoeksinspanningen van ons laboratorium in de toekomst verrijken.

[Verteller] Voeg om te beginnen twee milliliter 0,25% volume-tot-volume trypsine EDTA-oplossing toe aan een schaaltje van 10 centimeter. Kantel de schaal voorzichtig om ervoor te zorgen dat het hele oppervlak bedekt is. Zuig vervolgens de overtollige trypsine-ethyleendiaminetetracetzuuroplossing op. Plaats de schaal in een broedmachine op 37 graden Celsius en broed twee minuten uit. Voeg vervolgens 10 milliliter kweekmedium toe aan het gerecht. Piket met een pipet voorzichtig op en neer om de cellen van het oppervlak los te maken en de volledige celsuspensie op te vangen in een conische buis van 15 milliliter. Neem nu ongeveer 10 microliter van de celsuspensie en laad deze in een cellenteller om het aantal cellen te bepalen. Zorg ervoor dat het gemeten aantal een opbrengst van ongeveer 10 miljoen cellen bevestigt of pas indien nodig aan. Centrifugeer de resterende celsuspensie gedurende vijf minuten bij 120 x g. Zuig na het centrifugeren het supernatant op en gooi het weg. Resuspendeer de resulterende celpellet in vier milliliter 2% gewicht/volume alginaatoplossing en pipetteer langzaam om de vorming van luchtbellen te minimaliseren. Voeg nu 10 milliliter calciumchloride-oplossing van 50 millimol toe aan een centrifugebuis van 50 milliliter. Bevestig de spuit op de dop van de centrifugebuis met calciumchlorideoplossing. Zuig 300 microliter van het celalginaatmengsel op in een spuit van 0,5 milliliter die is uitgerust met een naald van 10 millimeter van drie graden. Sluit vervolgens de centrifugebuis goed af met de spuit die aan de dop is bevestigd, en plaats het geheel in de centrifuge om gedurende vijf minuten zachtjes te draaien op 200 x g. Verwijder het bovenstaande na centrifugatie en suspendeer de resulterende gel opnieuw in het kweekmedium. Breng vervolgens met behulp van een pasteurpipet de in de cel ingekapselde gel over in een NMR-buisje en breng de sponsbevestiging in om een goede afdichting te garanderen. Verwarm het middelgrote reservoir met 5% volume-tot-volume deuteriumoxide voor in een waterbad van 37 graden Celsius. Begin met de circulatie met een snelheid van ongeveer 500 microliter per uur om de omstandigheden te stabiliseren. Inspecteer de opstelling om er zeker van te zijn dat er geen lekken zijn voordat u verder gaat. Voeg 18 microliter koolstof 13-gelabeld pyrodruivenzuur in een concentratie van 14,2 molair gedoteerd met 25 millimolair OX063 toe aan een monsterflesje. Sluit de injectieflacon aan op het vloeistofpad van het dynamische nucleaire polarisatiepolarisatiesysteem. Plaats vervolgens de aangesloten flacon in de boring van de dynamische nucleaire polarisator. Pas microgolfbestraling toe bij ongeveer 188 gigahertz met een vermogen van 22 milliwatt voor een duur van 60 tot 80 minuten. Gebruik de solid-state nucleaire magnetische resonantiespectrometer die is geïntegreerd in het dynamische nucleaire polarisatiesysteem om de koolstof 13-signaalintensiteit te bewaken. Registreer de signaalgegevens elke vijf minuten met behulp van de besturingssoftware van het systeem. Los nu snel het gepolariseerde monster op in 3,2 milliliter oplosbuffer die is voorverwarmd tot biologische temperatuur. Laad het voorbereide monster in een NMR-buis en plaats de buis in de spectrometer. Start op de NMR-console de geautomatiseerde procedure om vergrendeling, afstemming, matching en shimming uit te voeren met het monster op zijn plaats om een optimale spectrale resolutie en signaalstabiliteit te garanderen. Laad een koolstof 13-pulsverkrijgingssequentie met protonontkoppeling ingeschakeld met behulp van een instelling zoals 13-CPD. Stel de flip-hoek in op 90 graden met een puls van één microseconde die is gelabeld als P1. Definieer vervolgens de acquisitietijd als 1,376 seconden, de spectrale breedte als 23.663 hertz en de acquisitiepunten, of TD, als 65.536. Stel de ontspanningsvertraging D1 in op nul seconden. Wijs 150 tijdsintervallen toe aan TD1 voor het verkrijgen van 150 sequentiële spectra in pseudo-2-dimensionale modus, en pas de ontvangerversterking aan op een lage waarde, zoals ongeveer één, om signaalverzadiging veroorzaakt door de hypergepolariseerde monsters te voorkomen. Stop nu de peristaltische pomp om de circulatie van het medium tijdelijk te stoppen voordat de gehyperpolariseerde oplossing door de inlaatslang wordt geïnjecteerd. Begin ongeveer 10 seconden voordat het gehyperpolariseerde substraat wordt opgelost met de spectrale acquisitie om ervoor te zorgen dat het signaal bij aankomst op de detectieplaats wordt opgevangen. Wanneer de oplossing de dynamische nucleaire polarisatiepolarisator verlaat, zuigt u er een milliliter van in een spuit. Zet de driewegklep bij de inlaat van de bioreactor in stand B om de gehyperpolariseerde oplossing in de NMR-buis te leiden. Nadat de injectie is voltooid, zet u de klep terug naar stand A om de mediumcirculatie te hervatten en terugstroming te voorkomen. Bevestig ten slotte dat de injectie succesvol was na het opmerken van een toename van het vrije inductievervalsignaal op de acquisitiesoftware. Zorg ervoor dat de uiteindelijke oplossing een temperatuur bereikt tussen 308 en 313 Kelvin en een pH van ongeveer zeven voordat u overgaat voor NMR-meting. Gehyperpolariseerde koolstof 13 NMR-spectra van hetzelfde SCCVII-cel ingekapselde monster werden met tussenpozen van 1,5 uur verkregen om de haalbaarheid van herhaalde niet-destructieve metingen te evalueren. De eerste NMR-meting toonde een duidelijk verhoogd lactaatsignaal, wat wijst op actieve metabole omzetting van pyruvaat naar lactaat. Daaropvolgende metingen met tussenpozen van 1,5 uur toonden een progressieve vermindering van de intensiteit van het lactaatsignaal aan, wat wijst op een verminderde metabolische activiteit in de loop van de tijd. In HeLa-cellen bevestigden de eerste metingen een succesvolle omzetting van pyruvaat naar lactaat met duidelijk waarneembare signaalpieken. Hoewel het signaal geleidelijk afnam als gevolg van T2-ontspanning, bleef de signaal-ruisverhouding gedurende de 60 seconden durende acquisitie adequaat, wat suggereert dat het huidige protocol breed toepasbaar is en kan dienen als een veelzijdig hulpmiddel voor real-time metabole profilering in verschillende celtypen.