Live beeldvorming karakterisering van centromeerbewegingen tijdens mannelijke meiotische profase in Arabidopsis thaliana

Ons onderzoek onderzoekt plantenmeiose, met als doel moleculaire mechanismen te ontdekken die homologe chromosoomherkenning, uitlijning en koppeling sturen tijdens de meiotische progressie. De uitdaging is om chromosoombeweging in meiotische profielen te visualiseren, wat live weefselbeeldvorming met hoge resolutie en snelheid vereist om trajecten te volgen. Om te beginnen verwijder je de beschermende folie van de afstandhouder aan één kant en plaats je deze in het midden van een glazen slede.

Verwijder dan de tweede beschermfolie. Stort acht microliter kraanwater in het midden van de afstandhouder. Met een pincet kies je een bloeiwijze uit een van de hoofdstengels.

Plaats de bloeiwijze op een nieuwe glaasje onder een stereomicroscoop met een liniaal. Kies bloemknoppen die ongeveer 0,5 millimeter lang zijn. Met scherpe naalden open je voorzichtig de knoppen door de kelkbladen en bloemblaadjes uit elkaar te trekken zodat alleen de helmknoppen behouden blijven.

Breng de medelbossen voorzichtig over in het water in de spacer-holte direct na het verwijderen van de kelkbladen en bloemblaadjes om uitdroging te voorkomen. Plaats nog een paar bundels in de spacer-holte. Om de glijbaan af te dekken met een deksel en luchtbellen te voorkomen, voeg acht microliter water toe aan een afdeklijst.

Draai dan voorzichtig de dekselsslip om met de druppel water naar de spacer-holte. Zorg ervoor dat de helmknoppen in totaal 16 microliter water worden ondergedompeld en dat de afdekkingssleuf goed aan de afstandhouder hecht. Stel de microscoop op door GFP op 488 nanometer te stimuleren en dit te detecteren met een hybride detector tussen 494 nanometer en 547 nanometer.

Lokaliseer vervolgens de helmknop met brightfield-verlichting. Met behulp van het brightfield-kanaal bepaal je het meiotische stadium op basis van de vorm van de cellen. Visualiseer de meandel op de software en gebruik het RFP-signaal als extra indicator van het meiotische stadium van de cellen.

Om continue acquisities uit te voeren, stel je het tijdsinterval in het tijdsgedeelte op nul. Gebruik dan de spotmodule om spots automatisch bij te houden. Kies het groene bronkanaal en stel de XY-diameter in op één micrometer voor het centromeer met GFPCENH3.

Pas vervolgens de detectiekwaliteit aan op basis van signaalintensiteit met behulp van de grafiek onderaan het controlevenster. Gebruik het auto-regressieve bewegingstracking-algoritme om centromeertrajecten te traceren en alle trajecten te visualiseren om meiocyten gemakkelijk te onderscheiden van somatische weefsels. Gebruik vervolgens de spotmodule om vlekken in de tijd op de geselecteerde kern te volgen.

Definieer een interessegebied door het optiesegment te selecteren, slechts een interessegebied, en voer spottracking binnen deze uit te voeren. Kies een interessegebied dat de kern correct omvat in alle drie dimensies en in de tijd. Gebruik in een afstammingsplot de 3D-viewer van de software om alle trajecten te visualiseren.

Verwijder de trajecten buiten de geanalyseerde meiocyt door ze te selecteren en op de delete-toets op het toetsenbord te drukken. In bewerkingsmodus verwijder of voeg je een object toe, zodat het object in het juiste vlak wordt toegevoegd. In de edit tracks-modus verbind je handmatig de nieuwe objecten op de afstammingsgrafiek nadat je de cel grondig in 3D hebt geanalyseerd.

Bereken de onmiddellijke snelheid bij elke tijdstap om variaties in bewegingssnelheid over tijd te monitoren. Bereken de draaihoek als de verandering in bewegingsrichting tussen opeenvolgende tijdsstappen om trajectpatronen te onthullen. Sla het resultaat op samen met de directe snelheid.

Bereken de bereikratio met behulp van een celtracker om te meten hoe ver een gevolgd object beweegt ten opzichte van zijn startpositie, wat exploratief gedrag aangeeft. Bereken de gemiddelde snelheid van elk spoor om de bewegingskenmerken over de observatieperiode samen te vatten. Bereken de gemiddelde draaihoek per spoor om beweging, richting en gedragspatronen te analyseren en sla het resultaat op.

Vervolgens bereken je de centroidegrootte bij elke tijdstap om de ruimtelijke spreiding van centromeren rond hun gemiddelde positie te meten. Gebruik variaties in centroidgrootte in de loop van de tijd om globale consistentie over centromeersporen te evalueren en het resultaat op te slaan. Bereken de snelheidskruiscorrelatie om relaties te analyseren tussen de bewegingsdynamiek van verschillende gevolgde objecten, wat mogelijk gecoördineerd gedrag onthult.

Bereken vervolgens de gemiddelde kwadratische verplaatsing voor elk spoor om de gemiddelde vierkante afstand die centromeren over een gegeven tijdsinterval afleggen, te kwantificeren. Meiotische centromeren vertoonden een significant hogere gemiddelde snelheid van 109,35 nanometer per seconde in vergelijking met somatische centromeren. Meiotische centromeren vertoonden een breder bereik en een hogere genormaliseerde bereikratio vergeleken met somatische centromeren.

De draaihoekverdeling verschilde tussen meiotische en somatische centromeren. De gemiddelde kwadratische verplaatsing van meiotische centromeren nam in de loop van de tijd toe, terwijl somatische centromeren grotendeels statisch bleven. Dit protocol maakte voor het eerst kwantificering van de beweging van het meiotische chromosoom in Arabidopsis mogelijk, waardoor dramatische centromerendynamiek zichtbaar werd tijdens het zygotene- en pachytenestadium.

Dit protocol maakt het mogelijk om de bewegingen van genomische regio's tijdens de meiotische profase te bestuderen en kan worden aangepast voor toepassing in andere plantensoorten. Dit werkt maakt het mogelijk om chromosoombeweging en recombinatie-interactie te verkennen, waardoor het begrip van het mechanisme dat genetische diversiteit aandrijft tijdens plantgametenvorming verdiept.