Extractie van histonen uit klinische monsters voor epigenetisch profileren door middel van massaspectrometrie

De scope van ons onderzoek is het analyseren van epigenetische veranderingen in kankermonsters, het ontdekken van nieuwe diagnostische en prognostische biomarkers en het identificeren van potentiële doelwitten voor therapie. Een grote uitdaging bij klinische monsters is het beperkte materiaal en de door fixatie geïnduceerde artefacten. Met onze geoptimaliseerde workflow en DI-gevoeligheid MS kunnen we echter tot 50 histon PTM's kwantificeren uit slechts 1000 cellen.

We tonen aan dat massaspectrometrie histon PTM-veranderingen in klinisch monster kan kwantificeren, wat inzicht biedt in epigenetisch mechanisme en biomarkerontdekking en identificatie van geneesmiddeldoelen voor precisie-epigenetische therapieën mogelijk maakt. Ons protocol behandelt de noodzaak van robuuste, kwantitatieve en gevoelige profilering van histon PTM in verschillende soorten klinische monsters. Massaspectrometrie is ideaal voor histon-PTM-analyse, omdat het onbevooroordeelde detectie, gelijktijdige profilering en co-incidentie op hetzelfde peptide biedt, waardoor de beperking van antistofgebaseerde methoden wordt overwonnen.

Begin met het ontdooien van het versbevroren weefsel op ijs en snijd je met een scalpel of mesje een stuk van ongeveer 20 tot 30 milligram door, wat overeenkomt met ongeveer twee kubieke millimeter weefsel. Breng het gesneden weefselmonster over in een buisje van 1,5 milliliter. Snijd het weefsel met een schaar in kleine stukjes.

Voeg één milliliter vers bereide kernisolatiebuffer toe, aangevuld met de gespecificeerde proteaseremmers, en maal het weefsel opnieuw uit. Breng het monster over naar een neerwaartse homogeniseerder. Gebruik eerst de losse stamper en daarna de strakke stamper om het weefsel te homogeniseren totdat er geen zichtbare stukjes meer voor het blote oog overblijven.

Filter het gehomogeniseerde monster door een 100 micrometer celfilter om weefselresten te elimineren. Pipetteer het gefilterde monster krachtig op en neer met een pipet van 200 microliter om het plasmamembraan op te lossen. Breng het monster over in een nieuwe buis van 1,5 milliliter.

Plaats de buis in een centrifuge op de werkbank en draai op 2.300 G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius om de kernen te pelleten. Na het afwerpen van het supernatant wordt de nucleaire pellet opnieuw opgehangen in 50 tot 100 microliter nuclei-isolatiebuffer, aangevuld met 0,1% SDS om het nucleaire membraan op te lossen. Voeg vervolgens 250 eenheden Benzonase-nuclease toe aan het geresuspendeerde monster om nucleïnezuren te verteren.

Meng goed en laat het twee minuten incuberen bij 37 graden Celsius. Voor een optimale snijtemperatuur van bevroren monsters, was je de weefsels met ethanolwater en PBS voordat je ze fijnhakken en histonextractie doet. Voeg één milliliter paraffineoplosmiddel toe aan het FFPE-monster, genomen in een buis van 1,5 milliliter, en vortex op maximale snelheid gedurende 30 seconden totdat de paraffine volledig is opgelost.

Centrifugeer het monster op 16.000 G gedurende drie minuten op kamertemperatuur en gooi het supernatant voorzichtig weg met een pipet met een kleine tip die de pellet vermijdt. Voeg nu één milliliter 95% ethanol toe aan de pellet en laat het 30 seconden op maximale snelheid vortexen. Centrifugeer het monster op 16.000 G gedurende drie minuten op kamertemperatuur en gooi het supernatant weg.

Na het rehydrateren van het monster voeg je 200 microliter extractiebuffer toe aan de pellet. Homogeniseer het weefsel in de extractiebuffer door te fornikeren met een digitale signifier met een microtip van drie millimeter. Na homogenisatie incubeer je het monster in een thermomixer en open je kort het buisdeksel zodat het formaldehyde kan verdampen.

Na het centrifugeren van het monster, plaats je het supernatant in een nieuw gelabeld buisje. Verwijder de gelbanden die overeenkomen met het molecuulgewicht van kernhistoneiwitten tussen 10 en 18 kilodalton met behulp van een scalpel. Na het snijden van de gelbanden gebruik je hetzelfde scalpel om de gesneden gelstukken over te brengen in een buisje van 1,5 milliliter.

Om de gel te ontkleuren, voeg je een oplossing van 50% acetonitril toe in dubbel gedestilleerd water en incubeer je de buis in een thermomixer met 1.400 omwentelingen per minuut gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Dehydrateer de gelstukjes door 100% acetonitril toe te voegen. Meng in de thermomixer op 1.400 omwentelingen per minuut gedurende 10 minuten op kamertemperatuur.

Na het weggooien van het supernatant droog je de gelstukken vijf minuten op kamertemperatuur in een vacuümcentrifuge. Voeg vervolgens 15 microliter 7,7 molaire proponicanhydrideoplossing toe en 26 microliter één molaire ammoniumbicarbonaat aan elke buis en incubeer je. Daarna incubeer je het monster met 80 microliter van één molair ammoniumbicarbonaat.

Was daarna de gelstukken drie keer met dubbel gedestilleerd water en gooi de vloeistof na elke incubatie weg. Voeg vervolgens 50% acetonnitril toe aan de gelstukken en incubeer op 1.400 omwentelingen per minuut gedurende 15 minuten op kamertemperatuur. Voeg daarna 100% acetonitril toe om de gelstukken volledig te dehydrateren.

Incubeer in de thermomixer op 1.400 omwentelingen per minuut gedurende 15 minuten op kamertemperatuur. Na het weggooien van de vloeistof droog je de gelstukken vijf minuten op kamertemperatuur in een vacuümcentrifuge. Voeg vier microliter trypsineoplossing en 20 microliter verteringsbuffer toe aan elke tube met gelstukjes.

Incubeer de buizen 10 minuten op ijs zodat trypsine in de gel kan worden opgenomen. Zodra de trypsine volledig is opgenomen, voeg je 80 microliter digestiebuffer toe om de gelstukken volledig te bedekken en incubeer je de tubes een nacht op 37 graden Celsius in een thermomixer. Om de verteerde peptiden te extraheren, voeg je 100 microliter 100% acetonitril toe aan elke buis en incubeer je bij 1.400 omwentelingen per minuut gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur in een thermomixer.

Verzamel nu voorzichtig het supernatant en doe het over in een nieuwe buis van 1,5 milliliter. Na het herhalen van de aceto nitro-extractie met de resterende gel, verzamel je de supernatanten. Concentreer de opgehoopte peptiden in een vacuümcentrifuge totdat het volume tussen één en vijf microliter ligt.

Voeg vervolgens twee microliter van één molaire triethylammoniumbicarbonaat en drie microliter fenylisocyanaatoplossing toe. Incubeer het monster 90 minuten lang bij 37 graden Celsius op 350 omwentelingen per minuut in een thermomixer. Om de derivitisatie te stoppen, voeg je acht microliter 1% trichloorazijnzuur toe aan elke buis.

Verdun tenslotte elk monster door 100 microliter buffer A toe te voegen en laden de verdunde monsters op C18-traptips voor elusie. Histonenextractie werd succesvol uitgevoerd uit vers bevroren, OCT-bevroren en FFPE-monsters met behulp van differentiële verwerkingsprocessen die specifiek waren voor elk weefseltype. Ondanks lagere verrijking en achtergrondproteïneaanwezigheid werden histon H3, H2A, H2B en H4 succesvol uit FFPE-monsters geëxtraheerd, zoals aangetoond door banden in de FFPE1 en FFPE2 van de lane, wat overeenkomt met ongeveer één microgram van de H3.1-standaard.

Nanovloeistofchromatografie en MS-analyse van FFPE-afgeleide histonen toonden een succesvolle scheiding van histonpeptiden over een gradiënt van 55 minuten, met duidelijke pieken in de retentietijd in het totale ionenchromatogram. Geëxtraheerde ionenchromatogrammen bevestigden de detectie en kwantificering van ongemodificeerde en gemethyleerde vormen van H3 K vier met afzonderlijke elusieprofielen voor elke M bij Z-waarde. Maakt het mogelijk om het percentage relatieve abundantie voor elke wijziging te berekenen.

Vergelijkende analyse van histonmodificaties tussen normale en tumormonsters toonde significante stijgingen in bepaalde typen en een afname van andere typen in tumorweefsels.