Expansiemicroscopie: Fluorescentiebeeldvorming met hoge resolutie met een conventionele microscoop

Wij zijn celbiologen die de rol van microtubuli en hun bijbehorende functie in verschillende modelorganismen onderzoeken. We streven ernaar hun rol in cellulaire organisatie, morfogenese, ciliogenese en deling te onderzoeken. In de afgelopen vijf jaar hebben we bijgedragen aan het begrip van de circulaire moleculaire samenstelling, met name door het gebruik van expansiemicroscopie.

En hiermee onthullen we het belangrijkste kenmerk van hun assemblage en functie. Door expansiemicroscopie te combineren met cryofixatie, maakt ons protocol beeldvorming met hoge resolutie mogelijk, terwijl de bijna-native structuur van het cellulaire element behouden blijft, wat de belangrijkste beperking van superresolutiemicroscopie overwint. Expansiemicroscopie is een goedkope en eenvoudig te implementeren techniek die toegang geeft tot alle laboratoren tot superresolutie.

Om te beginnen gebruik je een spuit en een naald om elke vijf-milliliter buis te vullen met één milliliter extra droge aceton onder een chemische kap. Plaats de buizen rechtop in een metalen rek en doe ze in vloeibare stikstof om in te vriezen. Vul de helft van een 30 bij 30 centimeter dikke, polystyreen doos met droogijs en vul vervolgens de Vitrobot-achtige dewar met vloeibare stikstof totdat de verdamping stopt.

Verwijder nu de spin uit het dompelapparaat en vul de metalen dompelkamer met vloeibare ethaan. Wacht 10 minuten om het ethaan in evenwicht te laten komen. Pak vervolgens een dekbriefje van 12 millimeter met een dunne pincet en dep het op een vloeipapier om overtollig medium van het dekbed op te zuigen.

Houd de deklaag halverwege, met een pincet dat is uitgerust met een klemring die compatibel is met de cryo-plunger. Plaats de pincet die het dekstuk vasthoudt in de cryo-zuigerhouder en gebruik Whatman-papier om eventueel overgebleven medium weg te vegen. Activeer de cryo-plunjer om de coverslip in de ethaanoplossing in de metalen kamer te plaatsen.

Breng vervolgens snel de coverslip over in de tube met bevroren aceton. Incubeer de buizen met de dekfolies in droogijs onder een hoek van ongeveer 45 graden. Plaats de gesloten container op een orbitale shaker die staat ingesteld op 50 tot 100 RPM en roer de nacht op vier graden Celsius zodat de temperatuur geleidelijk kan stijgen.

Verwijder vervolgens het grootste deel van het droogijs uit de doos. Blijf nog eens 45 minuten met bewegen op de orbitale shaker zodat de temperatuur kan stijgen van min 80 graden Celsius naar min 20 graden Celsius. Open en sluit kort elke buis om de interne druk los te laten.

Vervolgens wordt elke deklaag overgebracht in een plaat met 12 putten of een geschikte container die vooraf is gevuld met voorgekoelde 100% ethanoloplossing. Na een incubatie van vijf minuten rehydrateer je de coverslips door een gegradeerde ethanolserie. Na het overbrengen van de dekmantels naar PBS, leg ze onder een microscoop.

Gebruik fijne pincetten om voorzichtig het oppervlak te krasen en oriënteer alle dekfolies met de juiste kant naar boven. Plaats de dekmantels in een plaat met vier gaten gevuld met 0,5 tot één milliliter 2% acrylamide en 1,4% formaldehydeoplossing in PBS. Incubeer vervolgens de coverslips in deze oplossing bij 37 graden Celsius zonder roeren.

Vervolgens ontdooi je 10% APS en laat je de gelatieoplossing 10 minuten op ijs liggen voordat je begint met geleren. Bereid een vochtige kamer voor met een dunne laag nat weefsel en Parafilm. Bewaar het daarna op vier graden Celsius.

Na 10 minuten plaats je de vochtige kamer op een koud blok voor gebruik tijdens de gelatie. Verwijder nu de dekfolies uit de eiwitankeroplossing en dep overtollig vocht met vloeipapier in twee opeenvolgende sessies weg. Voeg APS toe aan de gelatieoplossing om een uiteindelijke concentratie van 0,5% en vortex gedurende twee tot drie seconden te bereiken.

Pipetteer vervolgens twee druppels van 35 microliter op de Parafilm in de vochtige kamer en plaats elke deklaag voorzichtig over een druppel, waarbij de cellen naar beneden wijzen in de gelatieoplossing. Breng de vochtige kamer over in een incubator van 37 graden Celsius gedurende 30 tot 60 minuten. Voor denaturatie gebruik je een biopsiepunchtool met een diameter van 0,4 centimeter om gelstukken te verwijderen en plaats je deze in een zes-wellen plaat gevuld met één milliliter denaturatiebuffer.

Beweeg de plaat 10 tot 15 minuten totdat de gels loskomen van de dekfolie, en breng de losgekomen gelstukken over in 1,5 milliliter microcentrifugebuizen gevuld met verse denaturatiebuffer. Incubeer de gels 90 minuten bij 95 graden Celsius. Na het incuberen doe je de gels 10 minuten over in dubbel gedestilleerd water voor het wassen.

Meet de diameter van de gels met millimeterpapier om de gelexpansiefactor te evalueren. Bedekkingsslips schoon met ongeveer 200 microliter polylysineoplossing. Incubeer de coverslips een uur op kamertemperatuur, en was ze daarna drie keer met dubbel gedestilleerd water om overtollige polylysine te verwijderen.

Nadat de dekfolies droog zijn, bewaar je ze op vier graden Celsius tot verder gebruik. Breng de gel correct georiënteerd, met de cellen naar boven gericht, op pluisvrij papier en laat het drogen om overtollig water te verwijderen. Tot slot monteer je de gedroogde gels met de cellen naar beneden op Poly-D-Lysine-gecoate dekfolie.

Cryofixatie behield het mitochondriale netwerk in RPE1-cellen effectiever dan PFA-fixatie, zoals aangetoond door NHS-ester en ATP5A-kleuring, en maakte resolutie van mitochondriale cristae mogelijk, die niet zichtbaar waren bij PFA-fixatie. Cryofixatie resulteerde in een beter behoud van dynamische microtubuli, waaronder cytoplasmatische en astrale microtubuli in mitotische RPE1-cellen, in vergelijking met PFA-fixatie. Trypanosoma brucei, cryofixatie behield de architectuur van het mitochondrium en de algemene cellulaire structuur beter dan PFA-fixatie, zoals zichtbaar met TDH- en NHS-esterkleuring.

Bovendien behield cryofixatie het endoplasmatisch reticulum beter dan PFA-fixatie gebaseerd op BIP-kleuring. Er werden scheuren waargenomen in cryogefixeerde RPE1-cellen, maar deze verstoorden niet de ultrastructuur van organellen, zoals mitochondriën of microtubuli. Slechte cryofixatie werd aangegeven door bubbelachtige structuren en golvende microtubuli, gepaard met verlies van de integriteit van membraneuze organelen.

De uitzettingskwaliteit was afhankelijk van de helderheid van natriumacrylaatoplossingen, waarbij bruikbare oplossingen kleurloos of licht geel en doorschijnend leken, terwijl onbruikbare oplossingen troebel en oranje leken.