Labeling stamcellen met fluorescente kleurstoffen voor niet-invasieve detectie met optische beeldvorming

Welkom in het laboratorium van Dr. Hiku Alge Blink. Wij willen het California Institute of Regenerative Medicine bedanken voor de financiering van dit project. Het labelen van stamcellen met een fluorescent contrastmiddel maakt in vivo tracking van getransplanteerde stamcellen mogelijk.

Vervolgende optische beeldvorming van de gelabelde stamcellen maakt longitudinale studies mogelijk waarbij de migratie van de cellen in vivo niet-invasief kan worden gemonitord. Deze video laat zien hoe u zowel humane embryonale stamcellen als humane mesenchymale stamcellen labelt met fluorescente kleurstoffen. Hallo, ik ben Sophie Boddington van de Contrast Agent Research Group van de afdeling Radiologie aan de University of California in San Francisco.

Vandaag wil ik u twee verschillende technieken laten zien voor het labelen van stamcellen met fluorescerende contrastmiddelen. Eén voor het labelen van mesenchymale stamcellen met de fluorescerende kleurstof DID, en een andere voor het labelen van menselijke embryonale stamcellen met endign ingra. Laat ik beginnen met het tonen van onze techniek voor het labelen van menselijke mesenchymale stamcellen met DID.

Om te beginnen met de procedure voor het labelen van mesenchymale stamcellen, moeten we deze trypsiniseren en tellen om een suspensie met een gedefinieerd aantal cellen te verkrijgen. Aangezien dit een standaardtechniek voor weefselkweek is, zullen we dit niet in detail tonen. We willen de cellen die we gaan labelen suspenderen in serumvrij kweekmedium met een dichtheid van 1 miljoen cellen per milliliter.

Eerst voegen we vijf µL DID-contrastmiddel per mL cel-suspensie toe. Vervolgens mengen we de oplossing door voorzichtig te pipetteren; de cellen worden geïncubeerd met de labelingsoplossing in een six-well low-attachment dish bij 37 °C gedurende 20 minuten. Zodra de incubatie is voltooid, moet de cel-oplossing worden overgebracht naar een 15 mL centrifugebuis.

We centrifugeren dit bij 400 RCF gedurende vijf minuten. Vervolgens zuigen we het labelingsmedium af, waarbij we erop letten het pellet niet te verstoren. We wassen de cellen nu met PBS.

We pipetteren de cellen op en neer om ervoor te zorgen dat het celaggregaat wordt opgebroken. De laatste twee stappen herhalen we nog twee keer, zodat we in totaal drie wasstappen hebben.

Nu tellen we de cellen en voeren we een trypaanblauwtest uit om de celviabiliteit te bepalen. Na het bepalen van de celviabiliteit zijn uw cellen klaar om te worden afgebeeld in de optische imager. Om te beginnen met de procedure voor het labelen van menselijke embryonale stamcellen, moeten we eerst het contrastmiddel Indocyanine Green prepareren.

Vervolgens mengen we dit met het transfectiemiddel protamine. Om te beginnen wegen we één milligram indocyaninegroen-poeder af en lossen we dit op in 100 µL DMSO. We voegen 400 µL DMEM met 10% FCS toe aan het mengsel en schudden dit goed, waardoor we een concentratie van twee mg/mL indocyaninegroen verkrijgen.

Vervolgens voegen we het transfectiemiddel protamine toe, dat fungeert als een transportmiddel voor het contrastmiddel, waardoor het de cel efficiënter kan binnendringen. We mengen nu 5 µL protaminesulfaat met een concentratie van 10 mg/mL met 300 µL ICG en 300 µL serumvrij DMEM. Daarna schudden we de nieuwe transfectieoplossing gedurende vijf minuten om de vorming van complexen mogelijk te maken.

Vervolgens zuigen we het oude medium af en voegen we 10 milliliters VOORVERWARMD DMEM toe aan de cellen. We voegen de eerder bereide protamine ICG-oplossing toe aan de cellen en starten de incubatie van één uur door de schaal in de incubator bij 37 degrees Celsius te plaatsen. Nadat de incubatie is voltooid, halen we de schaal uit de incubator, zuigen we de labelingsoplossing af en wassen we de cellen door de schaal te spoelen met vijf milliliters PBS.

De cellen worden vervolgens gedurende vijf minuten bij 37 °C getrypsiniseerd. Door de schaal te schudden, worden de cellen gemakkelijker in suspensie gebracht. Vervolgens pipetteren we voorzichtig op en neer om de resterende kolonies op te lossen.

We neutraliseren de trypsine door een gelijke hoeveelheid DMEM met 10% FCS aan de schaal toe te voegen. Vervolgens brengen we de celoplossing over in een buis van 15 milliliter en centrifugeren we de oplossing gedurende vijf minuten bij 400 RCF. We resuspenderen de cellen in volledig medium.

We kunnen nu resterende klonten of complexen verwijderen door de cellen door een 40 micrometer cell strainer te halen. Zodra we een klontvrije celoplossing hebben, aspireren we het oude medium en resuspenderen we het pellet in voorverwarmd volledig menselijk embryonaal stamcelmedium. Op dit punt moeten we de muis-feeder-cellen scheiden van de menselijke embryonale stamcellen.

Dit wordt gedaan om ervoor te zorgen dat we later alleen de stamcellen afbeelden. Hiervoor brengen we de cellenoplossing over naar een met gelatine gecoate Petri-schaal van 10 centimeter. We plaatsen de schaal in de 37 °C incubator en laten deze 45 minuten rusten.

Zorg er tijdens deze tijd voor dat de schaal niet wordt verstoord. De feeder-cellen zullen nu aan de schaal hechten, terwijl de stamcellen dat niet doen. We gieten de oplossing uit de Petrischaal en we hebben nu een gelabelde enkelceloplossing van humane embryonale stamcellen.

We kunnen nu de cellen tellen en een trypaanblauw-test uitvoeren. Na bevestiging van de levensvatbaarheid zijn onze cellen klaar om te worden afgebeeld. De slide toont een voorbeeld van hoe stamcellen in vivo in muizen kunnen worden gevisualiseerd nadat ze zijn gelabeld met een fluorescent contrastmiddel en zijn toegediend via een IP-injectie.

Seriële optische beeldscans toonden een initiële accumulatie van de cellen in de longen, gevolgd door herverdeling in de lever, het beenmerg van de extremiteiten en de schildklier. De fluorescentielabel kan ook worden gebruikt voor directe weergave van getransplanteerde stamcellen in histopathologische monsters met fluorescentiemicroscopie. We hebben zojuist gedemonstreerd hoe stamcellen kunnen worden gelabeld met fluorescente contrastmiddelen bij het uitvoeren van celmarkering.

Het is belangrijk om te onthouden dat elke stap moet worden gestandaardiseerd. We doen dit om een consistente labelingsefficiëntie en celviabiliteit te waarborgen, zodat resultaten van verschillende experimenten met elkaar vergeleken kunnen worden. Dat is alles.

Bedankt voor het kijken en veel succes met het labelen van uw cellen.