Name: Labeling stamcellen met fluorescente kleurstoffen voor niet-invasieve detectie met optische beeldvorming (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-02T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Leer stamcellen labelen met fluorescerende kleurstoffen voor niet-invasieve in vivo tracking. Deze methode maakt optische beeldvorming en histopathologische analyse van humane embryonale en mesenchymale stamcellen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit project werd ondersteund door een Leon J. Thal SEED subsidie ​​van het California Institute voor regeneratieve geneeskunde. Tobias Henning werd gefinancierd door een Research beurs van de Duitse Research Association (DFG, HE 4578/1-2). Wij willen dankbaar Juanito Meneses te erkennen voor zijn advies over de cultuur van menselijke embryonale stamcellen.

Etikettering van mesenchymale stamcellen met de fluorescerende kleurstof DiD <ol><li> Om te beginnen van de procedure voor het labelen van mesenchymale stamcellen, trypsinize en tellen van de cellen om een ​​schorsing te krijgen met een bepaald aantal cellen. </li><li> Neem de cellen uit de incubator en zuig die oude media uit de kolven met de cellen te worden geëtiketteerd </li><li> Was de cellen met 10 ml Mg / Ca-vrij PBS. Aspireren de PBS. De Mg en Ca zou remmen het trypsine, dus we PBS te gebruiken zonder deze. </li><li> Voeg voorverwarmde 0,05% trypsine, voor een T75 fles die we gebruiken 5ml. Zorg ervoor dat het gehele oppervlak van de kolf is bedekt. </li><li> Incubeer bij 37 ° C in de incubator voor ongeveer 5 minuten. </li><li> Bevestig het detachement onder de microscoop. Als de cellen blijven aan de kolf, tikt er een paar keer en wacht een iets langer totdat de behandeling met trypsine succesvol is. </li><li> Nu, is het noodzakelijk om de trypsine te neutraliseren door het toevoegen van media met 10% FCS. We maken gebruik van een gelijke hoeveelheid media als er trypsine. </li><li> Pipet op en neer een paar keer om ervoor te zorgen dat alle cellen opnieuw worden gesuspendeerd in de media. </li><li> Breng de cel oplossing voor een steriele 15ml bedekte polypropyleen buis. </li><li> Centrifugeer bij 400 RCF gedurende 5 minuten. </li><li> Aspireren uit het supernatant ervoor te zorgen niet naar de cel pellet te verstoren. </li><li> Resuspendeer de cellen in DMEM en ga verder met het celgetal. </li><li> Hang de cellen worden gelabeld met een dichtheid van 1x10 ^ 6 per ml in serum-vrij kweekmedium (DMEM). </li><li> Dit was allemaal voorbereiding van de celsuspensie. Nu is het klaar om de etikettering te starten. </li><li> Voeg eerst 5 ul DiD contrastmiddel per ml celsuspensie. </li><li> Vervolgens mengen de oplossing door voorzichtig pipetteren. </li><li> Incubeer de cellen met de etikettering oplossing bij 37 ° C gedurende 20 minuten in een 6-well low-attachment schotel. </li><li> Zodra de eenvoudige incubatietijd is voltooid, is het noodzakelijk om de cel oplossing over te dragen aan een 15 ml polypropyleen bedekte buis. </li><li> Centrifugeer het neer op 400 RCF gedurende 5 minuten. </li><li> Aspireren uit de etikettering medium, waardoor niet naar cel pellet te verstoren. </li><li> Was de cellen met PBS. Pipetteer de cellen op en neer, en zorg ervoor dat breken de cel pellet. </li><li> Herhaal de laatste twee stappen twee keer, dus er is een totaal van drie wasstappen. </li><li> Tel het aantal cellen en het uitvoeren van een trypan blue test levensvatbaarheid van de cellen te bepalen. Dit zijn standaard celkweek protocollen die wij niet gaan hier uit te leggen. </li><li> Uw cellen zijn nu klaar om te worden afgebeeld in optische imager. </li></ol> Etikettering van menselijke embryonale stamcellen met de fluorescerende kleurstof ICG <ol><li> Om te beginnen van de procedure voor het labelen van menselijke embryonale stamcellen, de voorbereiding van de contrastmiddel Green Indocyanine. Meng het met de transfectie-agent Protamine. </li><li> Meet 1 mg van het indocyaninegroen poeder. Los van de ICG poeder in 100 pi van dimethylsulfoxide (DMSO). </li><li> Voeg 400 ul van Dulbecco&#39;s Modified Eagles Medium (DMEM + 10% foetaal kalfsserum) media aan het mengsel en goed schudden. Dit resulteert in een uiteindelijke concentratie van 2mg/ml van Indocyanine Green. </li><li> Voeg de transfectie-agent Protamine. Protamine fungeert als een shuttle naar het contrastmiddel, zodat het wordt in de cel efficiënter. </li><li> Mix 5 microliter protaminesulfaat, die wordt geleverd bij een concentratie van 10mg/ml, met 300 il ICG en 300 pi serum vrij Dulbecco&#39;s Modified Eagles Medium. </li><li> Schud de nieuwe transfectie-oplossing gedurende 5 minuten te laten complex te vormen. </li><li> De etikettering oplossing is klaar. </li><li> Zuigen uit de oude media uit hESC 10mm petrischaal. </li><li> Voeg 5 ml van de voorverwarmde serum-vrij DMEM. </li><li> Voeg de vooraf bereide Protamine / ICG oplossing voor de cellen. Start het 1 uur incubatie door het plaatsen van de schotel in een incubator bij 37 ° C. </li><li> Na de incubatie is voltooid, verwijdert u de schotel uit de incubator en zuig de etikettering oplossing. </li><li> Was de cellen door het spoelen van de schotel met 5 ml PBS. </li><li> Aspireren van de PBS-en te vervangen door 5 ml van 0,25% trypsine. Incubeer de schotel op 37 ° C gedurende 5 minuten om trypsine te komen. Het helpt om de schotel te schudden een beetje elke keer in een tijdje. </li><li> Voorzichtig pipet op en neer, te breken de resterende kolonies. </li><li> Neutraliseer de Trypsine door het toevoegen van een gelijke hoeveelheid van KSR aan het gerecht. </li><li> Breng de cel oplossing om een ​​15 ml buis en centrifugeer de oplossing bij 400 RCF gedurende 5 minuten. </li><li> Resuspendeer de cellen in volle media. </li><li> Als er nog steeds massa&#39;s op dit punt, trypsinize en centrifuge opnieuw. </li><li> Zodra een pol-vrije cel oplossing is bereikt, zuigen uit de oude media en resuspendeer de pellet in 10 ml van de voorverwarmde vol ESC media. </li><li> Op dit punt, is het noodzakelijk om de muis feeder cellen van de hESC &#39;s te scheiden. Dit is gedaan om ervoor te zorgen dat, later, maar de beeldvorming van de stamcellen zich voordoet. </li><li> Voor deze, overdracht stee cel oplossing voor een gelatine coating 10 cm schotel. </li><li> Zet de schotel in de 37 ° C incubator en laat het zitten voor 45 minuten. Gedurende deze tijd, zorg ervoor dat niet aan het gerecht te verstoren. Nu zal de feeders houden aan de schotel en de stamcellen niet. </li><li> Breng de oplossing uit de petrischaal. en nu hebben we een gelabelde enkele cellen oplossing van menselijke embryonale stamcellen. </li><li> De cellen kunnen nu worden geteld en een trypan blue test kan worden uitgevoerd op hen. </li><li> De cellen zijn klaar om te worden afgebeeld! </li></ol>

<ol><li>Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Metz, S., Piontek, G., Settles, M., Pichler, B., Heinzmann, U., Weinmann, H. J., Schlegel, J., Link, T. M., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+tracking+with+Gadophrin-2+--+a+bifunctional+contrast+agent+for+MR+imaging%2C+optical+imaging+and+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Stem cell tracking with Gadophrin-2 -- a bifunctional contrast agent for MR imaging, optical imaging and fluorescence microscopy.</a> Eur J Nucl Med Mol Imaging. 31, 1312-1321 (2004).</li>
<li>Simon, G. H., Daldrup-Link, H. E., Kau, J., Metz, S., Schlegel, J., Piontek, G., Saborowski, O., Demos, S., Duyster, J., Pichler, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+experimental+arthritis+using+allogeneic+leukocytes+labeled+with+a+near-infrared+fluorescent+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Nucl+Med+%26+Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of experimental arthritis using allogeneic leukocytes labeled with a near-infrared fluorescent probe.</a> Eur J Nucl Med & Mol Imaging. 33, 998-1006 (2006).</li>
<li>Sutton, E., Henning, T., Pichler, B., Bremer, C., Daldrup-Link, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Tracking+with+Optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Radiol%22%5BJournal%5D)">Cell Tracking with Optical imaging.</a> Eur Radiol. 2, 350-357 (2003).</li>
<li>Funovics, M. A., Alencar, H., Su, H. S., Khazaie, K., Weissleder, R., Mahmood, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+multichannel+near+infrared+endoscope+for+mouse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Miniaturized multichannel near infrared endoscope for mouse imaging.</a> Mol Imaging. 2, 350-357 (2003).</li>
</ol>

OI is een relatief nieuwe beeldvormende techniek, gebaseerd op de detectie van fluorescentie. OI is zo gevoelig als radiotracer op basis van beeldvormende technieken, maar niet geassocieerd met een bestraling blootstelling. OI biedt een effectief middel van het bijhouden cellen niet-invasieve en herhaaldelijk, waardoor inzicht in cel migratie naar de beoogde locatie. Een belangrijke beperking van de techniek is de beperkte penetratie van fluorescerende probes in vivo. Zo, een tracer accumulatie in diepe weefsels, meer dan ongeveer 5-10 cm v...

<table><tbody><tr><td>Indocyaninegroen (IR-125)</td><td>Reagens</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC41254-1000</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-2650</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM High Glucose </td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>Verdunnen tot een eindconcentratie van 0,1% in PBS</td></tr><tr><td>PBS, Mg- en Ca-vrij</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA 0,05% </td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA 0,25% </td><td>Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>25200-114</td><td></td></tr><tr><td>FCS, gekarakteriseerd</td><td>Reagens</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Celzeef (40 &amp;mu;m Nylon)</td><td>Reagens</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>DiD</td><td>Reagens</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>V-22887</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacer</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>β-mercapto&amp;#8211;ethanol </td><td>Reagens</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7522</td><td></td></tr><tr><td>Niet-essentiële aminozuren </td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Reagens</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine 200mM </td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Reagens</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Protamine-sulfaat</td><td>Reagens</td><td>American Pharmaceutical Partners</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

labeling stamcellen met fluorescente kleurstoffen voor niet-invasieve detectie met optische beeldvorming

 Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optische beeldvorming (OI) is een eenvoudige, snelle en goedkope tool voor in vivo monitoring van nieuwe stamceltherapieën. De techniek is gebaseerd op ex vivo etikettering van stamcellen met een fluorescerende kleurstof, latere intraveneuze injectie van de gelabelde cellen en visualisatie van hun accumulatie in specifieke doelorganen of pathologieën. De gepresenteerde techniek laat zien hoe we menselijke mesenchymale stamcellen (hMSC) label door eenvoudige incubatie met de lipofiele fluorescerende kleurstof DiD (C67H103CIN2O3S) en hoe we menselijke embryonale stamcellen (hESC) label met de FDA goedgekeurde fluorescerende kleurstof Indocyanine Green (ICG). De opname mechanisme is via de hechting en de verspreiding van de lypophilic kleurstof over de fosfolipide celmembraan bilaag. De etikettering rendement is meestal verbeterd als de cellen worden geïncubeerd met de kleurstof in serum-vrije media, in tegenstelling tot incubatie in serum-bevattende media. Bovendien is de toevoeging van de transfectie-agent protaminesulfaat verbetert aanzienlijk contrastmiddel opname.

Deze video toont technieken voor de etikettering van menselijke embryonale stamcellen en mesenchymale stamcellen met fluorescerende kleurstoffen. Deze techniek kan worden gebruikt voor een in-vivo volgen van getransplanteerde stamcellen met optische beeldvorming en voor histopathologisch correlaties met fluorescentie microscopie.

Labeling stamcellen met fluorescente kleurstoffen voor niet-invasieve detectie met optische beeldvorming

Optische beeldvorming (OI) is een eenvoudig, snel en goedkoop instrument voor in vivo monitoring van nieuwe op stamcellen gebaseerde therapieën. De techniek is gebaseerd op ex vivo ...

Welkom in het laboratorium van Dr. Hiku Alge Blink. Wij willen het California Institute of Regenerative Medicine bedanken voor de financiering van dit project. Het labelen van stamcellen met een fluorescent contrastmiddel maakt in vivo tracking van getransplanteerde stamcellen mogelijk.Vervolgende optische beeldvorming van de gelabelde stamcellen maakt longitudinale studies mogelijk waarbij de migratie van de cellen in vivo niet-invasief kan worden gemonitord. Deze video laat zien hoe u zowel humane embryonale stamcellen als humane mesenchymale stamcellen labelt met fluorescente kleurstoffen. Hallo, ik ben Sophie Boddington van de Contrast Agent Research Group van de afdeling Radiologie aan de University of California in San Francisco.Vandaag wil ik u twee verschillende technieken laten zien voor het labelen van stamcellen met fluorescerende contrastmiddelen. Eén voor het labelen van mesenchymale stamcellen met de fluorescerende kleurstof DID, en een andere voor het labelen van menselijke embryonale stamcellen met endign ingra. Laat ik beginnen met het tonen van onze techniek voor het labelen van menselijke mesenchymale stamcellen met DID.Om te beginnen met de procedure voor het la

labeling-stem-cells-with-fluorescent-dyes-for-non-invasive-detection

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Voor de evaluatie van nieuwe stamcellen therapieën is het belangrijk om niet-invasief spoor de geïnjecteerde cellen in vivo. Deze video toont u hoe de menselijke mesenchymale en embryonale stamcellen met ijzeroxide gebaseerde contrastmiddelen label in vivo voor latere MR imaging in vivo.

Etikettering hESC &#39;s en hMSCs met ijzeroxide nanodeeltjes voor niet-invasieve in vivo Tracking met MR Imaging

Met de groeiende belangstelling voor stamceltherapieën, moleculaire imaging technieken zijn ideaal voor de bewaking stamceltransplantatie gedrag na transplantatie. Luciferase reporter genen hebben ingeschakeld non-invasieve, repetitieve evaluatie van de overleving van de cel, de locatie en de proliferatie in vivo. Deze video zal laten zien hoe je hESC proliferatie track in een levende muis.

In vitro en in vivo bioluminescente reportergen-beeldvorming van menselijke embryonale stamcellen

We beschrijven een techniek voor etikettering en het bijhouden van stamcellen met FDA-goedgekeurde, superparamagnetische ijzeroxide (SPIO), ferumoxytol (Feraheme). Deze cellulaire beeldvorming techniek die magnetische resonantie (MR) beeldvorming maakt gebruik van voor visualisatie, is gemakkelijk toegankelijk voor de lange termijn monitoring en diagnose van succesvolle of mislukte stamcellen engraftments bij patiënten.

Labeling stamcellen met Ferumoxytol, een FDA-goedgekeurd ijzeroxide Nanodeeltje

Combinatorische 5 fluorescerende eiwitten markering van hematopoietische stamcellen en voorlopercellen maakt in vivo klonale volgen via confocale en twee-foton microscopie, het verstrekken van inzicht in het beenmerg hematopoietische architectuur tijdens de regeneratie. Deze methode maakt het mogelijk niet-invasieve lot in kaart brengen van spectraal-gecodeerde HSPCs-afgeleide cellen in intacte weefsels voor langere perioden na de transplantatie.

In vivo Klonale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen Gekenmerkt door Five fluorescerende eiwitten met behulp van confocale microscopie en Multiphoton

In dit artikel beschrijven we de principes voor het ontwerpen en uitvoeren van een multi-kleurig lijn-traceringsexperiment met behulp van R26R-Confetti muizen. We bieden een specifiek protocol voor het volgen van hoornvliesepitheelcellen die kunnen worden aangepast voor andere weefsels van belang.

Een methode voor Lineage Tracing van hoornvliescellen De Multi-kleur Fluorescent Reporter Muizen

Door celtransplantatie, cytoskelettenlabeling en verlies/winst van functiebenaderingen te combineren, beschrijft dit protocol hoe de migrererende zebravis prospectieve prechordale plaat kan worden gebruikt om de functie van een kandidaatgen in in vivo celmigratie te analyseren.

analyseren<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Migratie behulp Cell Transplantaties en Time-lapse Imaging in zebravis embryo&#39;s

Dit protocol beschrijft een efficiënte manier om te controleren de cel persistentie en ook menselijke adipeus afkomstige mesenchymale stamcellen (haMSCs) door far-red fluorescentie labeling in een rat knie artrose (KOA) model via intra-articulaire (IA) injectie.

In Vivo Bijhouden van menselijke adipeus afkomstige mesenchymale stamcellen in een Rat knie artrose Model met fluorescerende lipofiele membraan kleurstof

Met behulp van humane primaire prostaat Epitheelcellen, rapporteren we een nieuwe biomarker-vrije methode van functionele karakterisering van stam-achtige cellen door een spheroid-gebaseerde label-retentie test. Een stap-voor-stap protocol wordt beschreven voor BrdU, CFSE of far Red 2D Cell labeling; driedimensionale spheroid-formatie; Label-behoud stam-achtige celidentificatie door immunocytochemie; en isolatie door FACS.

Isolatie van stam-achtige cellen uit 3-dimensionale Spheroid-culturen

Dit protocol beschrijft strategieën voor het identificeren en verrijken van de celtoestand in neurale stamcelculturen van primaire volwassen muizen door middel van autofluorescentiebeeldvorming met behulp van i) een confocale microscoop, ii) een fluorescerend geactiveerde celsorteerder om intensiteitsbeeldvorming uit te voeren, of iii) een multifotonenmicroscoop om fluorescentiebeeldvorming uit te voeren.

Classificatie van neurale stamcelactiveringstoestand in vitro met behulp van autofluorescentie

De hier beschreven intravitale beeldvormingsmethode maakt gebruik van collageen tweede harmonische generatie en endogene fluorescentie van de metabole co-factor NAD (P) H om een niet-invasieve tumormicro-omgeving te segmenteren in tumor-, stromale en vasculaire compartimenten voor diepgaande analyse van 4D intravitale beelden.

Een labelvrije segmentatiebenadering voor intravitale beeldvorming van de micro-omgeving van borsttumoren

De muizensnijtand bevat waardevolle labelhoudende cellen in zijn stamcelniche. We hebben een nieuwe manier om de labelvasthoudende cellen onbevooroordeeld te detecteren en te kwantificeren; onze studie gebruikte EdU-etikettering en een 3D-reconstructiebenadering na PEGASOS-weefselverwijdering van de onderkaak.

Detectie en kwantificering van labelvasthoudende cellen in muizensnijtanden met behulp van een 3D-reconstructiebenadering na weefselverwijdering

Leer stamcellen labelen met fluorescerende kleurstoffen voor niet-invasieve in vivo tracking. Deze methode maakt optische beeldvorming en histopathologische analyse van humane embryonale en mesenchymale stamcellen mogelijk.

Labeling stamcellen met fluorescente kleurstoffen voor niet-invasieve detectie met optische beeldvorming

Meer video's verkennen