Ultrasone lokalisatiemicroscopie voor het in kaart brengen met superresolutie van de microvasculatuur van de hersenen van knaagdieren

Ons onderzoek heeft als doel de microvasculaire architectuur en stroming van de hersenen te karakteriseren, terwijl we superresolutie-ultrageluidsmethoden verfijnen. Recente ontwikkelingen hebben het volgen van microbubbels geoptimaliseerd en de verwerkingspijplijnen versterkt om stabielere protocollen te creëren voor superresolutie vasculaire mapping met ULM. Om te beginnen plaats je een verdoofde muis op een stereotaxisch frame met een verwarmingskussen ingesteld op 37 graden Celsius.

Met stevige maar niet-schadelijke druk knijp je in de teen of staart om te controleren of er geen reflexen zijn en om voldoende diepte van de anesthesie te controleren. Breng oogzalf aan op beide ogen om oogzweren en staarvorming tijdens de procedure te voorkomen. Scheer nu de kop van de muis met een trimmer.

Breng depuutcrème aan. Laat het maximaal één tot anderhalve minuut intrekken, spoel het daarna grondig af met warm water en droog het met gaas. Breng vervolgens gecentrifugeerde ultrageluidsgel aan op de kop om akoestische koppeling te garanderen.

Voor staartaderkatheterisatie gebruik je een 27 gauge halve inch vleugelinfuusset, verbonden met een 18 gauge halve inch naald met acht inch buis. Kort de buis indien mogelijk in om het dode volume te minimaliseren. Draai de staart van het dier voorzichtig 90 graden om de laterale staartaren bloot te leggen.

Daarna zet je de staart vast met tape om stabiliteit te behouden en beweging tijdens de katheterisatie te voorkomen. Identificeer nu de staartader. Om de zichtbaarheid van de ader te verbeteren, verwarm je de staart met lauw water om vasodilatatie te bevorderen.

Met een vinger oefen je zachte druk uit aan de basis van de staart en schuif je deze richting de injectieplaats tegen de richting van de bloedstroom in. Steek de naald parallel aan de ader met de afschuining naar boven gericht. Controleer de slang op bloedflashback om de juiste naaldplaatsing te bevestigen.

Start op het beeldvormingssysteem de functionele ultrageluidsverwervingssoftware en maak een nieuwe experimentele sessie. Pas de positie van de echosonde aan. Start nu de live view-opname in de software en pas de probe in realtime aan met Power Doppler-beeldvorming om de hersenen op het scherm te centreren.

Optimaliseer de beeldparameters, zoals contrast en compressie, om de visualisatiekwaliteit te verbeteren. Open vervolgens het Angio 3D-menu in de acquisitiesoftware. Pas de scanparameters aan zodat ze de hersenen volledig bedekken, en begin dan met de scan.

Houd de acquisitiesoftware open en zodra de Angio 3D klaar is, start je de IcoStudio-software voor analyse en visualisatie. Laad de Angio 3D-scan voor een review. Navigeer naar het hersenregistratiepaneel en registreer de Angio 3D-scan met de volledig automatische of handmatige modus.

Sla de voltooide registratie op als een BPS-bestand. Open nu het navigatiemenu Brain en scroll naar beneden naar het Atlas managerpaneel. Gebruik de navigator voor ouder- en kindboomstructuur om de Allen Mouse hersenatlas te bekijken en selecteer de gewenste anatomische gebieden voor overlay in het drie-weergavepaneel.

Kies een beeldvlak dat overlapt met de geselecteerde interessegebieden. In het coronale beeld plaats je handmatig twee markers om de gewenste beeldsnede te definiëren. Klik vervolgens op BPS Positioning om de motorcoördinaten van het geselecteerde beeldvlak te extraheren.

Bekijk de beeldpreview van de Angio 3D-scan en klik op BPS-coördinaten kopiëren. Schakel over naar de IcoScan-software en open het Move-probepaneel. Klik op Neuronavigatie, plak de gekopieerde waarden en laat het systeem de probe automatisch uitlijnen met het geselecteerde beeldvlak.

Begin vervolgens met live beeldvorming om te bevestigen dat het huidige beeldvlak uitlijnt met het eerder geselecteerde vlak. Met een steriele spuit injecteer je vijf milliliter 0,9% natriumchlorideoplossing in het microbubbelflesje van het ultrageluidscontrastmiddel via het tussentussenschotel. Beweeg het flesje krachtig gedurende 20 seconden om de microbellen opnieuw te laten ophangen en een gelijkmatige spreiding te garanderen.

Bepaal vooraf de opnameparameters, waaronder de echosequentie, framerate en totale opnameduur. Vervolgens trek je het gewenste volume microbellen voor injectie en begin je met de opname. Zodra de verwerving begint, injecteer je 100 microliter voor muizen met de juiste verdunning.

Bevestig contrastversterking op het live visualisatiepaneel. Spoel onmiddellijk de resterende microbellen in het dode volume door fysiologische vloeistof in de katheter te injecteren. Wacht tot de acquisitie klaar is en sla de opgenomen gegevens op.

Open de Icolab-software en klik op het tabblad Ultrasoon lokalisatiemicroscopie. Klik vervolgens op Compute ULM maps om de verwerkingsworkflow te starten. Selecteer de bronmap die de eerder verkregen gegevens bevat.

Selecteer vervolgens het specifieke scanbestand om te verwerken en pas de verwerkingstijdgrenzen aan indien nodig. Klik op Volgende om naar de rapportagestap te gaan. Stel het pad voor de uitvoermap in voor het opslaan van de verwerkte bestanden en configureer de visualisatieparameters voor de rapportafbeeldingen.

Klik nu op Run om de data te verwerken. Na voltooiing wordt een TRK-bestand gemaakt met gelokaliseerde microbubbelcoördinaten, samen met TIFF-bestanden die dichtheid, snelheid en terugverstrooide amplitude weergeven. Laad het TRK-bestand in IcoStudio om de verwerkte data te verkennen.

Gebruik vervolgens het rechterpaneel in IcoStudio om visualisatieparameters zoals contrast, compressie en kleurkaart aan te passen voor een verbeterde dataweergave. Om de integratietijd in te stellen, pas je de dubbele schuifregelaar onderaan de hoofdweergave aan om de start- en eindframes voor de analyse te definiëren. Het dichtheidstabblad toont de verdeling van microbubbelvoorkomen.

Kies tussen absolute dichtheid en richtingsdichtheid. Klik daarna op het Velocity-tabblad om de microbubbelsnelheid in millimeters per seconde weer te geven met absolute, directionele, axiale en laterale modi. Pas de contrast-, compressie- en snelheidsdrempels aan om de beeldhelderheid te verbeteren.

Bekijk vervolgens het tabblad Backscattered Amplitude om de reflectiviteit van microbubbels te bekijken, wat het contrast versterkt en microvasculaire structuren en beweging buiten het vlak onthult. Exporteer afbeeldingen als PNG's met hoge resolutie, of genereer TIFF-bestanden voor kwantitatieve analyse met aanpasbare pixelgrootte. Microbubbeldichtheidskaarten van een coronale rat-hersensnede die met ULM was verkregen, losten zowel grote vaten als fijne capillaire structuren op, en onthulden gedetailleerde vasculaire topologie, waaronder bifurcaties en vertakkingspatronen.

De snelheidskaart van dezelfde hersensnede toonde duidelijke axiale richting, waarbij opwaartse stroming veneuze drainage aanduidt en neerwaartse stroming overeenkomt met arteriële perfusie, wat overeenkomt met de bekende corticale vasculaire architectuur. De terugverstrooide amplitudekaart gaf diepte-afhankelijk contrast en markeerde vaartuigen op basis van hun elevatiepositie, nuttig om schepen buiten het vlak of met lage amplitude te segmenteren. Vasculaire dichtheidskaarten die één zwakke afstand in dezelfde muis verkregen, vertoonden sterke ruimtelijke overlap, wat de reproduceerbaarheid van coronale vlakgerichte targeting met behulp van het hersenpositioneringssysteem bevestigde.

Kwantitatieve analyse van de linker somatosensorische cortex over sessies heen toonde vergelijkbare verdelingen in vatradius, snelheid en debietsnelheid, wat de reproduceerbaarheid van de meting aantoonde. Vergelijkbare reproduceerbaarheid werd waargenomen in de linker thalamusregio, met consistente waarden voor vatradius, snelheid en debiet tussen de sessies van week één en week twee. Dit werk stelt vast dat ultrasone lokalisatiemicroscopie betrouwbaar superresolutiekaarten van microvasculaire structuur en stroming in vivo kan produceren.

Dit protocol voorziet in de behoefte aan een gestandaardiseerde procedure die robuuste ULM-opnames bij levende knaagdieren mogelijk maakt met behulp van een speciaal functioneel echografiesysteem.