Transiënte optische klaring met behulp van absorberende moleculen voor ex vivo en in vivo beeldvorming

Dit onderzoek heeft tot doel weefselopruiming te evalueren en te implementeren met behulp van absorberende moleculen als een niet-invasieve strategie om biomedische beeldvorming in zowel ex vivo weefsels als levende dieren te verbeteren. We hebben aangetoond dat de voedingskleurstof tartrazine kan worden gebruikt om een snelle en omkeerbare optische klaring te bereiken in zowel weefsels als levende dieren, waardoor de beelddiepte en helderheid aanzienlijk worden verbeterd. Ons protocol pakt een kritieke lacune in de reproduceerbaarheid van transiënte optische klaring aan door moleculen te observeren, en bevat geavanceerde computationele visualisatietechnieken om de zichtbaarheid van kenmerken te verbeteren.

Door een gedetailleerd protocol te bieden voor het opruimen van weefsel met absorberende moleculen, helpt ons werk de bredere onderzoeksgemeenschap op het gebied van biologie en biomedische beeldvorming om deze methoden in hun eigen studies toe te passen. Ons laboratorium heeft deze technologie verder ontwikkeld door de fysieke interactie tussen licht en weefsel te onderzoeken, het scala aan beschikbare materialen uit te breiden en geoptimaliseerde optische beeldvormingsplatforms te ontwikkelen. Bereken om te beginnen de benodigde massa tartrazinekleurstofpoeder om het gewenste oplossingsvolume te bereiden.

Breng de berekende hoeveelheid verfpoeder over in een schone glazen injectieflacon. Voeg met behulp van een volumetrische pipet de vereiste hoeveelheid gedeïoniseerd water toe aan de injectieflacon om de precisie te behouden. Als de kleurstof niet volledig oplost bij kamertemperatuur, plaats de glazen injectieflacon dan in een laboratoriumoven die is voorverwarmd tot 40 graden Celsius gedurende 10 minuten of totdat deze volledig is opgelost.

Draai vervolgens de kleurstofoplossing gedurende 30 seconden tot een minuut om volledige oplossing te garanderen. Snijd voor het ex vivo weefsel een kipfilet weefsel op de gewenste dikte in een richting parallel aan de collageenvezels en reinig het gesneden weefsel voorzichtig met water. Plaats het weefsel tussen twee schone microscoopglaasjes om de dikte te meten.

Druk de objectglaasjes voorzichtig tegen elkaar en gebruik een noniuskaliber om de afstand in het midden van het weefsel te meten. Week vervolgens de tissue in de voorbereide verfoplossing. En plaats de container op een orbitale schudder en schud gedurende 10 minuten met 100 omwentelingen per minuut.

Verwijder het weefsel uit de verfoplossing met een schone tang. Plaats het monster tussen twee transparante glazen dia's en maak foto's met een digitale of wetenschappelijke camera die is ingesteld op de juiste resolutie en vergroting. Voer het beeldvormingsproces uit in een gecontroleerde lichtomgeving om externe lichtinterferentie te minimaliseren.

Om de optische transmissie te meten, plaatst u het voorbereide monster in een UV-zichtbare nabij-infraroodspectrometer. Zorg ervoor dat het systeem goed is onderlijnd en dat de lichtstraal voor en na behandeling met kleurstofoplossing door hetzelfde weefselgebied gaat om de meetconsistentie te behouden. Plaats voor de procedure het verdoofde dier op een verwarmingskussen dat is getemperd op 37 graden Celsius.

Knip met een tondeuse voor kleine dieren de vacht van het gewenste beeldvormingsgebied. Breng ontharingscrème minder dan 60 seconden aan op het getrimde gebied om eventuele haarresten te verwijderen en verwijder de crème onmiddellijk. Reinig de huid met alcoholdoekjes om irritatie te voorkomen.

Om de beeldvormingsopstelling voor te bereiden, plaatst u een verwarmingskussen dat is ingesteld op 37 graden Celsius onder het dier om onderkoeling te voorkomen. Lijn de lichtbron en de camera uit om beelden van hoge kwaliteit vast te leggen. Gebruik een 0,65 molaire tartrazine-oplossing gemengd met 0,3% tot 0,4% agarosegel voor toepassing.

Breng met behulp van een druppelaar de bereide oplossing aan op de huid, op de buik of het hoofd, afhankelijk van het experiment. Laat de oplossing een paar seconden intrekken om de absorptie te beginnen. Schrob nu met een wattenstaafje voorzichtig het toepassingsgebied om de oplossing gelijkmatig te verdelen en de opname door de huid te verbeteren.

Masseer het gebied vervolgens zachtjes met een schoon wattenstaafje en breng indien nodig meer oplossing aan. Let op het verschijnen van oranjerode stippen, die geleidelijk overgaan in een uniforme kleur, wat wijst op een succesvolle penetratie van de kleurstof en het begin van optische klaring. Ga door met het masseren van het gebied totdat de huid transparant wordt en inwendige organen zichtbaar zijn, wat meestal ongeveer drie tot vijf minuten duurt voor een klein gebied.

Plaats voorzichtig een glazen objectglaasje of afdekglaasje over de huid om de glans van het oppervlak te verminderen en reflectie te minimaliseren. Verwijder de verfoplossing voorzichtig van de huid met een wattenstaafje of een zachte doek bevochtigd met water. Het optische zuiverende effect zal omkeren en de huid zal geleidelijk terugkeren naar zijn oorspronkelijke ondoorzichtige uiterlijk.

Nadat u de gasanesthesie hebt uitgeschakeld, laat u het dier weer bij bewustzijn komen. Zodra het dier volledig wakker en mobiel is, brengt u het terug naar zijn thuiskooi. In onbehandeld ex vivo kippenborstweefsel waren de onderliggende patronen niet zichtbaar en spectrometergegevens vertoonden lage transmissiewaarden die afnamen met toenemende weefseldikte.

Na behandeling met een 0,65-molaire tartrazine-oplossing werden de weefsels zichtbaar transparant en kwamen de onderliggende raster- en logopatronen duidelijk naar voren. Er werden ook substantiële verhogingen van de transmissiewaarden waargenomen over alle diktes in het zichtbare spectrum. Bij levende muizen maakte de toepassing van 0,65 molaire tartrazine-oplossing het mogelijk om binnen enkele minuten na de behandeling de inwendige organen door de huid te visualiseren, wat een zichtbaar verhoogde transparantie in de buikstreek aantoonde.

Optische klaring van de hoofdhuid maakte visualisatie van cerebrale bloedvaten mogelijk zonder chirurgische verwijdering van de huid, wat de effectiviteit van de techniek voor beeldvorming van de hersenen aantoont. Het verhelderende effect was volledig omkeerbaar. Door het weefsel met water te spoelen, werd de troebelheid hersteld en keerde het normale uiterlijk van de huid binnen enkele uren terug, waarbij de haargroei gedurende meerdere dagen werd waargenomen.