Geoptimaliseerde minimaal invasieve transsclerale subretinale injectietechniek bij muizen

Subretinale injecties zijn een belangrijk hulpmiddel voor preklinisch onderzoek naar therapieën voor erfelijke netvliesaandoeningen. In deze video presenteren we een geoptimaliseerde, minimaal invasieve subretinale injectietechniek bij muizen. Transsclerale subretinale injecties zijn een uitstekende manier om materiaal af te geven aan fotoreceptoren en RPE.

Deze techniek is echter technisch uitdagend en vraagt om het ontwikkelen van een geoptimaliseerd protocol om de reproduceerbaarheid en toegankelijkheid te vergroten. Onze verbeteringen omvatten de ontwikkeling van een ooglidspeculum van de muis, preoperatieve toediening van atropine, het creëren van een pinpoint sclerotomie met behulp van een diamantmes en optimalisatie van de naaldgrootte en injectiebenadering. We hopen dat de consistentie, reproduceerbaarheid, uitstekende transductiedekking en minimale chirurgische schade van onze methode de toegankelijkheid van subretinale injecties voor de wetenschappelijke gemeenschap zullen verbeteren.

Onze optimalisaties maken het gemakkelijker en sneller om subretinale injecties bij muizen uit te voeren, experimentele variabiliteit te verminderen en de slagingspercentages van injecties te verbeteren. Deze techniek zal toekomstig preklinisch translationeel netvliesonderzoek mogelijk maken. Dien om te beginnen één milligram per kilogram atropine intraperitoneaal toe in een totaal volume van 50 microliter 30 minuten voordat u de subretinale injectie uitvoert.

Vul een glazen micronaald met het gewenste volume van de injectieoplossing. Bevestig de naald aan de micro-injector en stel de compensatiedruk in op vijf hectopascal om de capillaire werking tegen te gaan. Plaats de verdoofde muis onder een ontledende stereomicroscoop.

Breng een druppel van 0,5% proparacaïne aan op het oog om plaatselijke anesthesie te bereiken. Breng een druppel van een mengsel met 0,2% cyclopentolaat en 1% fenylefrine op het oog aan om de pupil te verwijden voor postoperatieve beeldvorming van de subretinale bleb en om intraoperatieve bloedingen te verminderen. Gebruik een op maat gemaakt miniatuurdraadspeculum om de superieure fornix bloot te leggen en het speculum te immobiliseren om handsfree terugtrekking van het bovenste ooglid mogelijk te maken.

Maak met een schuine Vannas-schaar een limbale incisie ongeveer een millimeter achter de limbus in het superieure bindvlies en het kapsel van Tenon om de superieure sclera bloot te leggen. Verwijder voorzichtig alle restanten van de capsule van Tenon op de injectieplaats. Pak nu de voorste rand van de conjunctivale peritomie en tenotomie vast met een vergrendelende tang.

Leid vervolgens voorzichtig de wereldbol af om de superieure sclera bloot te leggen. Breng onmiddellijk een druppel gebalanceerde gebufferde zoutoplossing aan op het oog om de blote sclera gehydrateerd te houden en een grotere optische vergroting te bereiken. Maak met een diamanten mes een pinpoint sclerotomie op ongeveer 12 uur en één tot twee millimeter van de limbus.

Het mes tangentieel ten opzichte van de sclera plaatsen om ervoor te zorgen dat de sclerotomie klein en ondiep is. Gebruik een chirurgische spons om voorzichtig alle uitgebalanceerde gebufferde zoutoplossing van het oogoppervlak te verwijderen. Houd de afgeschuinde naald in een ondiepe hoek ten opzichte van de sclera en steek de punt langzaam in de sclerotomie, waarbij u slechts 0,5 tot een millimeter vooruitgaat om toegang te krijgen tot de subretinale ruimte zonder het netvlies binnen te dringen.

Terwijl u de naald stevig vasthoudt, start u de injectie bij 500 hectopascal met behulp van het voetpedaal en houdt u gedurende 15 seconden continue druk. Verwijder de naald en observeer een gedeeltelijke reflux van de geïnjecteerde oplossing door de sclerotomieplaats, wat wijst op een succesvolle toediening omdat de subretinale ruimte niet het volledige volume van de geïnjecteerde oplossing kan bevatten. Verwijder voorzichtig de vergrendelingstang en het ooglidspeculum zonder druk uit te oefenen op de bol om extra reflux te voorkomen.

Breng onmiddellijk na de injectie een royale hoeveelheid glijmiddel oogzalf aan op het oog om te helpen bij de visualisatie van de subretinale bloeding. Een subretinale bleb was duidelijk zichtbaar op OCT onmiddellijk na transsclerale injectie, wat een succesvolle bevalling bevestigde. Om retinaal pigmentepitheel, of RPE, gericht op AAV-8-dystrofine 1-GFP te evalueren, werd geïnjecteerd, wat resulteerde in wijdverspreide groene fluorescentie over de epitheellaag, wat wijst op efficiënte en brede RPE-transductie met behulp van de transsclerale benadering.

AAV-8 rhodopsine GFP leidde tot een sterk groen fluorescerend signaal in staaffotoreceptoren, zichtbaar in zowel dwarsdoorsneden als fundusweergaven, wat wijst op succesvolle targeting en expressie in fotoreceptorcellen. AAV8-CAG-mCherry produceerde brede rode fluorescentie over de netvlieslagen, wat aantoont dat deze techniek in staat is om gegeneraliseerde transgenexpressie te ondersteunen buiten specifieke celtypen. Westerse blotting van retinale lysaten vertoonde ook een sterke groene fluorescerende eiwitexpressie met de hoogste niveaus die overeenkomen met het midden van de injectieblaas, waardoor fotoreceptortransductie met AAV8-rhodopsine GFP werd gevalideerd.

Optimalisatie van de AAV-titer met behulp van immunofluorescentieanalyse van netvliessecties maakt het mogelijk om de virale titer te selecteren die de transductie van ongeveer 90% van de doelcellen bereikt. In dit geval bijvoorbeeld produceerde een verdunning van één tot 10 van een AAV8 rhodopsine GFP-virale voorraad transgenexpressie in bijna alle fotoreceptoren. Daarentegen resulteerde een verdunning van één tot 100 in een ontoereikende transductiesnelheid.

Elektroretinogram toonde aan dat transsclerale injecties de normale werking van het netvlies behielden, terwijl transretinale injecties leidden tot significant verminderde A-golf- en B-golfresponsen, wat wijst op schade aan het netvlies.