Gelijktijdige labelvrije autofluorescentie multi-harmonische microscopie
August 29th, 2025
Dit protocol bevat een stapsgewijze handleiding voor de Simultaneous Label-free Autofluorescence Multi-harmonic (SLAM) microscopische techniek, inclusief details over het genereren van de laserlichtbron, het voorbereiden van een weefselmonster, het uitvoeren van beeldvorming en het analyseren van de gegevens. SLAM bevordert niet-lineaire microscopie door vier complementaire labelvrije contrasten te meten om de micro-omgeving van het weefsel te onderzoeken.
Gelijktijdige labelvrije autofluorescentie multi-harmonische microscopie, of SLAM-microscopie, legt unieke informatie vast in biologische monsters door niet-lineaire interacties met licht te meten. In ons lab gebruiken we deze techniek om leven en ziekte op microscopische schaal te bestuderen. We zien een verschuiving naar labelvrije multimodale beeldvorming, die rijkere inzichten biedt in cellulaire en weefselstructuren en -dynamiek, terwijl toxiciteit wordt vermeden en complementaire contrasten en correlaties tussen de modaliteiten mogelijk zijn.
Een state-of-the-art labelvrije niet-lineaire microscopen verkrijgen één signaal tegelijk, met het risico op verkeerde uitlijning, fotoschade en veel gelijktijdige processen. De SLAM lost deze problemen op door een strikt gecoregistreerd multimodaal contrast mogelijk te maken, wat zorgt voor betrouwbare ruimtelijke en temporele gegevens. Deze techniek maakt gelijktijdige excitatie en detectie van vier kanalen in een multifotonmicroscoop mogelijk.
Fotonische kristalvezel gebruiken om pulsen voor SHG-, THG- en twee- en drie-fotonfluorescentie te verbreden. SLAM legt gemultiplexte metabole structurele en dynamische celsignaleringsinformatie vast zonder uitlijningsartefacten of exogene labels, waardoor gestandaardiseerde kwantitatieve weefselanalyse mogelijk is. De toepassingen omvatten fundamentele biologie, translationeel onderzoek en ontdekking van biomarkers in oncologie, neurodegeneratie en weefselregeneratie.
Gebruik om te beginnen een spectrometer of optische spectrumanalysator om de laser na de parabolische spiegel te meten en de supercontinuümgeneratie van de fotonische kristalvezel te verifiëren. Draai de middenplaat na de polariserende straalsplitser om de breedte van het supercontinuüm te optimaliseren. Schakel de microscopie-autocorrelator in.
Stel in de software de detector in op de interne detector en stel het scanbereik in op 5 picoseconden om de volledige breedte van de pulsautocorrelatie vast te leggen. Deblokkeer de laser en lijn de autocorrelator uit met de straal die de pulsvormer verlaat totdat er een signaal verschijnt. Zorg ervoor dat rolluik 2 gesloten is.
Breng vervolgens de juiste onderdompelingsmedia, zoals water of olie, aan op de objectieflens. Plaats de externe detector van de autocorrelator op de microscooptafel en plaats deze direct boven het objectief. Zet nu de spiegels van de scangalvanometer aan om hun voltage op 0.
Open de sluiter en gebruik een fluorescerend doel om te bevestigen dat de straal de externe detector bereikt. Stel de autocorrelatordetector in op de externe detector. Pas vervolgens de positie van de trap aan totdat het signaal verschijnt.
Pas de polynomiale coëfficiënten van de pulsvormer aan om de pulsbreedte die door de autocorrelator wordt gemeten iteratief te minimaliseren. Naarmate de pulsbreedte afneemt, verkleint u het scanbereik dienovereenkomstig om de nauwkeurigheid en visualisatie van de autocorrelatiefunctie te verbeteren. Zorg ervoor dat de laserinvoer naar de fotonische kristalvezel is geblokkeerd en zet de laser aan.
Laat de laser 30 minuten opwarmen. Controleer of het straalpad vrij is van obstakels en plaats vervolgens een optische vermogensmeter in het straalpad net voor de fotonische kristalvezel. Druk op de bedieningsknop om sluiter 1 te openen en meet het ingangsvermogen.
Sluit sluiter 1 weer. Verplaats de vermogensmeter naar de uitgang van de fotonische kristalvezel na de parabolische spiegel. Open sluiter 1 en gebruik de drie-assige ingangstrap om het uitgangsvermogen te maximaliseren.
Laat de fotonische kristalvezel 10 minuten opwarmen, maximaliseer vervolgens het uitgangsvermogen opnieuw met behulp van de drie-assige trap en registreer de transmissie van de PCF. Verplaats de vermogensmeter achter het filter met neutrale dichtheid en draai het filter om het laservermogen dat het monster bereikt aan te passen. Vermenigvuldig het gemeten vermogen met de doorlaatbaarheid van de resterende optica om het samplevermogen te bepalen.
Zet nu de galvanometers en het podium aan. Start de acquisitiesoftware en voer de gewenste beeldvormingsparameters in. Plaats het monster op de objecttafel met hetzelfde onderdompelingsmedium dat eerder op de objectieflens is aangebracht.
Doe vervolgens de kamerverlichting uit en sluit de gordijnen om te voorkomen dat er omgevingslicht binnenvalt. Schakel vervolgens de voedingen en ampverliezers van de detector in. Sluit de lichtbak rond de microscooptafel.
Gebruik de elektronische bedieningsschakelaars om de detectorluiken 3-6 handmatig te openen. Druk in de acquisitiesoftware op de optie Klik om acquisitie te starten om SLAM-beeldvorming te starten. Pas de microscoopfocus aan met behulp van de knop van de stagecontroller totdat het monster duidelijk zichtbaar is.
Gebruik de joystick op de microscooptafelcontroller om het gewenste gezichtsveld te vinden. Eenmaal geplaatst, klikt u op Stoppen en resetten. Schakel op het tabblad Opslaan de optie Opgeslagen gegevens in op Ja.
Druk vervolgens op de optie Klik om acquisitie te starten en wacht tot de beeldvorming is voltooid. Om het monster tijdens de beeldvorming te manipuleren, sluit u de luiken van de detector en gebruikt u een zaklamp of hoofdlamp voor verlichting. Keer na de aanpassingen terug naar de beeldvormingsinstellingen.
Om de beeldacquisitie te beëindigen, sluit u de luiken van de detector, schakelt u de detectoren uit en schakelt u pas daarna de kamerverlichting in. Blokkeer de laser met sluiter 1 en schakel vervolgens de laser uit. Schakel de galvanometers en de stage uit en sluit de acquisitiesoftware.
Gooi het weefselmonster op de juiste manier weg en maak het werkstation schoon. Een goed gespleten fotonische kristalvezel vertoonde een plat uiteinde loodrecht op zijn as en een schoon gezicht. Slecht gespleten fotonische kristalvezels vertoonden schuine sneden, afgebroken vlakken en uitgesproken krassen of puin op het oppervlak.
Onjuiste behandeling of vervuiling resulteerde in zichtbaar vuil en deeltjesophoping rond het vezeloppervlak, waardoor het luchtgatenpatroon werd verdoezeld. Een verbrande kern met verduisterde gebieden duidde op een beschadigde fotonische kristalvezel aan het einde van zijn levensduur. Het supercontinuümspectrum besloeg ongeveer 975-1, 175 nanometer met een platte bovenkant en duidelijke spectrale modulaties.
Pulsautocorrelatie na compressie vertoonde een symmetrisch profiel met een smal halfmaximum over de volledige breedte, wat wijst op een goede pulsvorming. Goed functionerende supercontinuümbronnen produceerden sterke tweede en derde harmonische signalen. Een versmald supercontinuüm resulteerde in verlies van de intensiteit van het derde harmonische signaal met behoud van het tweede harmonische signaal.
Afwezigheid van pulsvorming verminderde alle niet-lineaire signalen drastisch, wat een zwak en contrastarm beeld opleverde. Succesvolle SLAM-beeldvorming van ex vivo nierweefsel toonde verschillende nefronstructuren met meerdere sterke optische signalen, waaronder derde harmonische generatie en NADPH-fluorescentie. Renale interstitiële collageenvezels waren identificeerbaar via sterke signalen van de tweede harmonische generatie.
Het beeld van de redoxratio toonde een verhoogd aëroob mitochondriaal metabolisme in de proximale tubuli van de nierschors in vergelijking met de medulla. Een tweede redoxratiokaart bevestigde ruimtelijke variatie in oxidatief en glycolytisch metabolisme, waardoor het differentiële energieverbruik in het weefsel werd versterkt.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol presenteert een gedetailleerde gids voor de gelijktijdige label-vrije Autofluorescentie Multi-harmonische (SLAM) microscopietechniek, die unieke informatie in biologische monsters vastlegt. SLAM breidt niet-lineaire microscopie uit door vier complementaire label-vrije contrasten te meten om de weefselmicro-omgeving te onderzoeken.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biofysica
- Microscopietechnieken
Achtergrond
- SLAM-microscopie meet niet-lineaire interacties met licht.
- Deze techniek maakt gelijktijdige excitatie en detectie van vier kanalen mogelijk.
- Het biedt rijkere inzichten in cellulaire en weefselstructuren.
- SLAM vermijdt toxiciteit en maakt complementaire contrasten over modaliteiten mogelijk.
Doel van het onderzoek
- Om leven en ziekte op microscopische schaal te bestuderen.
- Om problemen van onjuiste uitlijning en fotobeschadiging in traditionele beeldvorming te overwinnen.
- Om betrouwbare ruimtelijke en temporele gegevensverzameling mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van weefselmonsters voor beeldvorming.
- Het uitvoeren van beeldvorming met behulp van SLAM-microscopie.
- Analyseren van gegevens verkregen uit het beeldvormingsproces.
- Genereren van de laserlichtbron voor de microscopie.
Belangrijkste resultaten
- SLAM biedt geregistreerd multimodal contrast.
- Het verbetert het begrip van weefselmicro-omgevingen.
- Verzamelde gegevens zijn betrouwbaar en uitgebreid.
- SLAM-microscopie faciliteert geavanceerd biologisch onderzoek.
Conclusies
- SLAM-microscopie is een belangrijke vooruitgang in beeldvormingstechnieken.
- Het maakt gedetailleerde analyse van biologische monsters zonder labels mogelijk.
- Deze techniek staat op het punt om onderzoek op verschillende biologische gebieden te verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Simultaneous Label-Free Autofluorescence Multi-Harmonic (SLAM) microscopy enables multiplexed, quantitative imaging of tissue structure, metabolism, and cellular dynamics without exogenous labels. This capability addresses the need for standardized, artifact-free, and reproducible data in early discovery and translational research. SLAM's coregistered multimodal outputs support predictive confidence and mechanistic de-risking at critical pipeline inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of metabolic and structural features in native tissue environments.
- Supports functional target validation by correlating morphological and metabolic states.
- Reduces biological ambiguity by providing simultaneous, artifact-free multimodal readouts.
- Facilitates portfolio triage through robust, label-free phenotypic characterization.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, reproducible biological systems for downstream compound screening.
- Delivers quantitative, standardized outputs across multiple optical channels.
- Enables high-content, label-free assay development for multiplexed screening platforms.
- Improves screening reliability by eliminating alignment artifacts and photo-damage risks.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant metabolic and structural biomarkers.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling non-destructive tissue analysis.
- Provides risk-adjusted data for advancement decisions in oncology, neurodegeneration, and tissue regeneration research.
- Enhances predictive de-risking by integrating functional and morphological data in situ.
Pipeline & Workflow Integration
SLAM microscopy integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing standardized, quantitative imaging for hypothesis testing, assay development, and translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through multiplexed, label-free imaging.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for high-content screening workflows.
- Analytics: Provides coregistered measurements of metabolic, structural, and functional tissue features.
- Translational Research: Enables non-destructive, disease-relevant biomarker analysis in human and animal tissues.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized imaging platform for cross-program R&D applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enhances reproducibility across teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by providing robust, multiplexed data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nonlinear optics and advanced microscopy instrumentation.
- Demands access to ultrafast laser sources, photonic crystal fibers, and sensitive detection systems.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data processing pipelines.
- Adaptation across tissue types and disease models may require protocol optimization.
- Instrument maintenance and photonic crystal fiber handling are critical for consistent performance.
