Gelijktijdige labelvrije autofluorescentie multi-harmonische microscopie

Gelijktijdige labelvrije autofluorescentie multi-harmonische microscopie, of SLAM-microscopie, legt unieke informatie vast in biologische monsters door niet-lineaire interacties met licht te meten. In ons lab gebruiken we deze techniek om leven en ziekte op microscopische schaal te bestuderen. We zien een verschuiving naar labelvrije multimodale beeldvorming, die rijkere inzichten biedt in cellulaire en weefselstructuren en -dynamiek, terwijl toxiciteit wordt vermeden en complementaire contrasten en correlaties tussen de modaliteiten mogelijk zijn.

Een state-of-the-art labelvrije niet-lineaire microscopen verkrijgen één signaal tegelijk, met het risico op verkeerde uitlijning, fotoschade en veel gelijktijdige processen. De SLAM lost deze problemen op door een strikt gecoregistreerd multimodaal contrast mogelijk te maken, wat zorgt voor betrouwbare ruimtelijke en temporele gegevens. Deze techniek maakt gelijktijdige excitatie en detectie van vier kanalen in een multifotonmicroscoop mogelijk.

Fotonische kristalvezel gebruiken om pulsen voor SHG-, THG- en twee- en drie-fotonfluorescentie te verbreden. SLAM legt gemultiplexte metabole structurele en dynamische celsignaleringsinformatie vast zonder uitlijningsartefacten of exogene labels, waardoor gestandaardiseerde kwantitatieve weefselanalyse mogelijk is. De toepassingen omvatten fundamentele biologie, translationeel onderzoek en ontdekking van biomarkers in oncologie, neurodegeneratie en weefselregeneratie.

Gebruik om te beginnen een spectrometer of optische spectrumanalysator om de laser na de parabolische spiegel te meten en de supercontinuümgeneratie van de fotonische kristalvezel te verifiëren. Draai de middenplaat na de polariserende straalsplitser om de breedte van het supercontinuüm te optimaliseren. Schakel de microscopie-autocorrelator in.

Stel in de software de detector in op de interne detector en stel het scanbereik in op 5 picoseconden om de volledige breedte van de pulsautocorrelatie vast te leggen. Deblokkeer de laser en lijn de autocorrelator uit met de straal die de pulsvormer verlaat totdat er een signaal verschijnt. Zorg ervoor dat rolluik 2 gesloten is.

Breng vervolgens de juiste onderdompelingsmedia, zoals water of olie, aan op de objectieflens. Plaats de externe detector van de autocorrelator op de microscooptafel en plaats deze direct boven het objectief. Zet nu de spiegels van de scangalvanometer aan om hun voltage op 0.

Open de sluiter en gebruik een fluorescerend doel om te bevestigen dat de straal de externe detector bereikt. Stel de autocorrelatordetector in op de externe detector. Pas vervolgens de positie van de trap aan totdat het signaal verschijnt.

Pas de polynomiale coëfficiënten van de pulsvormer aan om de pulsbreedte die door de autocorrelator wordt gemeten iteratief te minimaliseren. Naarmate de pulsbreedte afneemt, verkleint u het scanbereik dienovereenkomstig om de nauwkeurigheid en visualisatie van de autocorrelatiefunctie te verbeteren. Zorg ervoor dat de laserinvoer naar de fotonische kristalvezel is geblokkeerd en zet de laser aan.

Laat de laser 30 minuten opwarmen. Controleer of het straalpad vrij is van obstakels en plaats vervolgens een optische vermogensmeter in het straalpad net voor de fotonische kristalvezel. Druk op de bedieningsknop om sluiter 1 te openen en meet het ingangsvermogen.

Sluit sluiter 1 weer. Verplaats de vermogensmeter naar de uitgang van de fotonische kristalvezel na de parabolische spiegel. Open sluiter 1 en gebruik de drie-assige ingangstrap om het uitgangsvermogen te maximaliseren.

Laat de fotonische kristalvezel 10 minuten opwarmen, maximaliseer vervolgens het uitgangsvermogen opnieuw met behulp van de drie-assige trap en registreer de transmissie van de PCF. Verplaats de vermogensmeter achter het filter met neutrale dichtheid en draai het filter om het laservermogen dat het monster bereikt aan te passen. Vermenigvuldig het gemeten vermogen met de doorlaatbaarheid van de resterende optica om het samplevermogen te bepalen.

Zet nu de galvanometers en het podium aan. Start de acquisitiesoftware en voer de gewenste beeldvormingsparameters in. Plaats het monster op de objecttafel met hetzelfde onderdompelingsmedium dat eerder op de objectieflens is aangebracht.

Doe vervolgens de kamerverlichting uit en sluit de gordijnen om te voorkomen dat er omgevingslicht binnenvalt. Schakel vervolgens de voedingen en ampverliezers van de detector in. Sluit de lichtbak rond de microscooptafel.

Gebruik de elektronische bedieningsschakelaars om de detectorluiken 3-6 handmatig te openen. Druk in de acquisitiesoftware op de optie Klik om acquisitie te starten om SLAM-beeldvorming te starten. Pas de microscoopfocus aan met behulp van de knop van de stagecontroller totdat het monster duidelijk zichtbaar is.

Gebruik de joystick op de microscooptafelcontroller om het gewenste gezichtsveld te vinden. Eenmaal geplaatst, klikt u op Stoppen en resetten. Schakel op het tabblad Opslaan de optie Opgeslagen gegevens in op Ja.

Druk vervolgens op de optie Klik om acquisitie te starten en wacht tot de beeldvorming is voltooid. Om het monster tijdens de beeldvorming te manipuleren, sluit u de luiken van de detector en gebruikt u een zaklamp of hoofdlamp voor verlichting. Keer na de aanpassingen terug naar de beeldvormingsinstellingen.

Om de beeldacquisitie te beëindigen, sluit u de luiken van de detector, schakelt u de detectoren uit en schakelt u pas daarna de kamerverlichting in. Blokkeer de laser met sluiter 1 en schakel vervolgens de laser uit. Schakel de galvanometers en de stage uit en sluit de acquisitiesoftware.

Gooi het weefselmonster op de juiste manier weg en maak het werkstation schoon. Een goed gespleten fotonische kristalvezel vertoonde een plat uiteinde loodrecht op zijn as en een schoon gezicht. Slecht gespleten fotonische kristalvezels vertoonden schuine sneden, afgebroken vlakken en uitgesproken krassen of puin op het oppervlak.

Onjuiste behandeling of vervuiling resulteerde in zichtbaar vuil en deeltjesophoping rond het vezeloppervlak, waardoor het luchtgatenpatroon werd verdoezeld. Een verbrande kern met verduisterde gebieden duidde op een beschadigde fotonische kristalvezel aan het einde van zijn levensduur. Het supercontinuümspectrum besloeg ongeveer 975-1, 175 nanometer met een platte bovenkant en duidelijke spectrale modulaties.

Pulsautocorrelatie na compressie vertoonde een symmetrisch profiel met een smal halfmaximum over de volledige breedte, wat wijst op een goede pulsvorming. Goed functionerende supercontinuümbronnen produceerden sterke tweede en derde harmonische signalen. Een versmald supercontinuüm resulteerde in verlies van de intensiteit van het derde harmonische signaal met behoud van het tweede harmonische signaal.

Afwezigheid van pulsvorming verminderde alle niet-lineaire signalen drastisch, wat een zwak en contrastarm beeld opleverde. Succesvolle SLAM-beeldvorming van ex vivo nierweefsel toonde verschillende nefronstructuren met meerdere sterke optische signalen, waaronder derde harmonische generatie en NADPH-fluorescentie. Renale interstitiële collageenvezels waren identificeerbaar via sterke signalen van de tweede harmonische generatie.

Het beeld van de redoxratio toonde een verhoogd aëroob mitochondriaal metabolisme in de proximale tubuli van de nierschors in vergelijking met de medulla. Een tweede redoxratiokaart bevestigde ruimtelijke variatie in oxidatief en glycolytisch metabolisme, waardoor het differentiële energieverbruik in het weefsel werd versterkt.