Microbioreactor-gebaseerde productie van ankerafhankelijke mesenchymale stromale cellen die voorbereid zijn op acuut respiratoire distress syndroom
December 12th, 2025
Er wordt een protocol beschreven voor de productie van ankerafhankelijke cellen door microcarrier-microbioreactoren als potentiële cellengebaseerde therapieën. Met een doel van acuut respiratoire noodsyndroom worden vergelijkbare celopbrengst en gunstige genexpressie ten opzichte van fles-gebaseerde procesomstandigheden geïllustreerd. Dit protocol is uitbreidbaar naar andere ankerafhankelijke cellen en doelindicaties.
We bestuderen hoe cellen interageren met hun omgeving, ook bij het produceren of produceren van cellen als therapieën. Hier behandelen we vragen over hoe ankerafhankelijke cellen zoals MSC's, mesenchymale stromale cellen of stamcellen kunnen worden geproduceerd om enkele barrières voor klinische translatie te overwinnen. Groeiende erkenning dat de variabiliteit van celpopulaties zowel de consistentie als de potentie van het eindproduct voor elke batch of persoon beïnvloedt.
Deze uitdagingen kunnen zelfs de goedkeuring van sommige celtherapieën beïnvloeden. We richten ons op een gap die een hoog aantal cellen per milliliter vloeistof kan bereiken, met hoge controle van de omgeving en op een manier die kan worden opgeschaald. Dit protocol biedt een manier om inline omgevingsmonitoring op te nemen voor cellen die afhankelijk zijn van ankerpunten, zoals MSC's.
Die procescontrole is een voordeel ten opzichte van kolven die nog steeds in de meeste laboratorium- en klinische producties worden gebruikt. Er zijn verschillende open vragen voor MSC's en andere celtypen die gevoelig zijn voor mechanische signalen. Hoe kan deze aanpak bijvoorbeeld helpen om cellen te ontwerpen om andere ziektevormen aan te pakken?
Om te beginnen verwijder je de doorzichtige plastic dop die aan fles LL in het flessenrek zit. Met een nieuwe steriele 50-milliliter spuit zonder zuiger sluit je de nozzle aan op fles LL. Giet het steriele gefilterde water in het spuitvat en injecteer het in fles LL. Vul fles L evenzo met 25 milliliter low-glucose DMEM zonder FBS, fles R met 25 milliliter steriele PBS en fles RR met acht milliliter anti-hechtingsspoeloplossing. Herhaal de procedure om het vereiste aantal verbruiksartikelen voor het experiment voor te bereiden.
Vervolgens voer je een zelftest uit op elke pod die in het experiment gebruikt zal worden. Zodra de pod alle controles van de zelftest succesvol heeft doorstaan, verwijder je de zelftestcassettes en plaats je ze in lichtbeschermde opbergzakken. Bevestig het verbruiksmateriaal aan de bioreactor.
Verwijder de groene tape van de verbruiksventielen en plaats de verbruiksartikelen in de pod. Plaats de klemmen weer en controleer op een sissend geluid om een veilige afdichting te bevestigen. Verbind de witte druksensorlijn, de rode luchtdruklijn en de blauwe vacuümleiding tussen de verbruiksstof en het basisstation of de pod.
Controleer of de zijinjectiepoort is vastgeklemd met een witte druppelvormige klem voordat je een nieuw experiment start. Klik op het Flush Bottles-icoon in de software-interface. Schakel de radioknop voor fles L in, selecteer Output to Waste en klik dan op Start Flush MSCserum.
In het venster Flesinhoud geef je aan dat MSCserum zich in fles R bevindt, die PBS bevat. Ga dan naar Manual Ops en voer drie Eject Wash-cycli uit op de afvalfles. In het venster Inhoud van de fles geeft aan dat MSCserum nu in fles RR zit, dat de anti-adherentie spoeloplossing bevat.
Ga terug naar Manual Ops en voer één Eject Wash-cyclus uit op de afvalfles. Spoel na 30 minuten de verbruiksstof uit met PBS. Leeg de reactor om te wachten op cel- en microcarrierinjectie.
Klik in het Manual Ops-paneel op Reoculeren. Laat het systeem gepauzeerd op het punt waar het dashboard een prompt toont om de reactor te inoculeren. Vervolgens pipette je een berekend volume van geresuspendeerde cellen in een 15-milliliter conische buis met microdragers voor elke conie.
Vul elke buis aan met tussen de 2,2 en 2,5 milliliter met verse, warme menselijke mesenchymale stamcelmedia. Werk met één of twee verbruiksartikelen tegelijk, haal ze uit het basisstation en breng ze naar de bioveiligheidskast. Haal het cel- en microcarriermengsel uit een vijf-milliliter spuit met een groene stompe naald van vier inch.
Injecteer het mengsel in de reactor. Pak de injectiepoortlijn bij de onderkant van de cassette vast en wees voorzichtig dat je de leiding niet losmaakt. Met een rollende beweging tussen duim en wijsvinger draai je de injectiepoortlijn twee volledige omwentelingen om een geknoopte knik in de lijn te creëren.
Steek de knoop in de uitsparingsruimte bij de basis van de injectiepoort en zet hem vast met een klein stukje laboratoriumtape. Daarna brengt je het verbruiksartikel terug naar het basisstation. Na het herhalen van de injectie voor alle verbruiksartikelen, navigeer je door de software-interface om aan te geven dat de inoculatie voltooid is.
Wanneer de software terugkeert naar de startpagina, verwijder dan de witte klem van de verbruiksuitvoerlijnen. Voer Manual Ops in en voer de Eject Excess functie uit met de Output Port ingesteld op P voor perfusie. Schakel de statische mengmodus in met een cyclus van 1.680 seconden aan en 120 seconden uit, en stel de mengfrequentie in op vijf hertz.
Om te beginnen met celoogst, gebruik je een spuit van één milliliter om 200 microliter Pronase en ongeveer 300 tot 400 microliter lucht op te zuigen. Draai de dop van de zijpoortinjectieleiding los en spuit de naaldloze klepconnector met 70% ethanol. Verwijder de tape van de geknoopte zijpoort injectielijn, maak de knoop los en maak de witte druppelvormige klem los.
Sluit nu de een-milliliter spuit aan en injecteer voorzichtig de Pronase in de reactor. Volg de vloeistof met lucht om een volledige levering te garanderen. Draai de druppelvormige klem weer in en sluit de injectieleiding weer af.
Daarna de verbruiksstof terugbrengen in de pod, alle leidingen opnieuw aansluiten, de witte C-klem verwijderen en verder mengen gaan. Zet de afvalfles en de fles met mediabron op ijs. Start een timer van vijf minuten en laat de Pronase de microcarriers in de reactor verteren.
Controleer na vijf minuten of de microcarriers zijn afgebroken door hun afwezigheid in de reactor te controleren. Oogst de cellen door Manual Ops in te voeren, stel het aantal cycli in op drie, kies Output Port W voor afval en klik op Eject Wash. Nadat de Eject Wash-cycli zijn voltooid, breng je de verbruiksstof over naar de biosafety-kast.
Haal vervolgens de inhoud van de afvalfles uit met een spuit van 10 of 20 milliliter. Doe de inhoud van de afvalfles in een 15-milliliter conische centrifugebuis. Centrifugeer de cellen op 300g gedurende vijf minuten.
Aspiraat het supernatant en evalueer de grootte van de celpellet. Omgevingscondities, waaronder pH, temperatuur, opgeloste zuurstof en kooldioxide, werden stabiel gehandhaafd gedurende de 10-daagse kweekperiode in het microbioreactorsysteem. De pH-variatie was significant lager in de microbioreactor vergeleken met de polystyreenkolf in weefselcultuur.
De celopbrengst was hoger in de microbioreactor dan in de T25-kolf, terwijl de cellevensvatbaarheid vergelijkbaar bleef. Van de 14 gemeten potentie-geassocieerde kritieke kwaliteitskenmerken vertoonden negen significant een hogere mRNA-expressie in de microbioreactorconditie vergeleken met de T75-kolf.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het produceren van aan ankerage afhankelijke cellen, zoals mesenchymale stromale cellen (MSC's), in een microbioreactor-omgeving. Het doel is om uitdagingen in klinische toepassingen aan te pakken door de celopbrengst en consistentie te verbeteren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Cel-gebaseerde therapieën
- Microcarrier-technologie
- Bioreactorsystemen
Achtergrond
- Aan ankerage afhankelijke cellen zijn cruciaal voor verschillende therapieën.
- Variatie in celpopulaties kan de consistentie en potentie van het product beïnvloeden.
- Regulatoire goedkeuring kan worden beïnvloed door productie-uitdagingen.
- Celproductie met hoge dichtheid is essentieel voor therapeutische toepassingen.
Doel van de studie
- Om een schaalbare methode voor het produceren van MSC's te ontwikkelen.
- Om de omgevingscontrole tijdens celkweek te verbeteren.
- Om inline monitoring van celgroeiomgevingen mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- Microcarrier-microbioreactorsysteem voor celkweek.
- Omgevingsmonitoringtechnieken geïntegreerd in het proces.
- Vergelijking van celopbrengst en genregulatie met traditionele methoden.
- Toepassing op acuut respiratoir distress-syndroom als gebruiksvoorbeeld.
Belangrijkste resultaten
- Vergelijkbare celopbrengst met fles-gebaseerde processen.
- Favorabele genregulatieprofielen waargenomen.
- Protocol uitbreidbaar naar andere aan ankerage afhankelijke cellen.
- Hoge controle over kweekomstandigheden bereikt.
Conclusies
- Dit protocol biedt een haalbare oplossing voor het produceren van MSC's.
- Het lost sleutelbarrières op voor klinische toepassing van celtherapieën.
- Mogelijkheid om regelgevende naleving te verbeteren door middel van verbeterde consistentie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Microbioreactor-based expansion of anchorage-dependent mesenchymal stromal cells (MSCs) addresses critical bottlenecks in cell therapy manufacturing by enabling high-yield, quality-controlled production at benchtop scale. This approach enhances predictive confidence in cell product consistency and potency, supporting translational continuity for acute respiratory distress syndrome and other indications. The method's tight environmental control and scalability position it as a strategic asset for early process development and portfolio triage in cell-based therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell-environment interactions relevant to therapeutic hypothesis testing.
- Supports functional validation of MSCs by maintaining critical quality attributes during expansion.
- Facilitates biological de-risking through controlled, reproducible culture conditions.
Screening & Assay Development
- Prepares validated MSC populations for downstream potency and quality assays.
- Standardizes expansion conditions to improve reproducibility and quantitative comparability.
- Delivers scalable, high-yield cell outputs suitable for screening and process optimization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns cell manufacturing with disease-relevant models for acute respiratory distress syndrome.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by preserving cell phenotype and potency.
- Reduces risk of late-stage failure by supporting robust, quality-by-design manufacturing principles.
Pipeline & Workflow Integration
This microbioreactor protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling rapid process development, early quality assessment, and scalable transition to larger manufacturing platforms.
- Discovery Biology: Provides a platform for hypothesis-driven testing of MSC function and environmental response.
- Screening: Ensures assay-ready, reproducible cell populations with quantitative output metrics.
- Analytics: Supports inline monitoring of pH, dissolved gases, and critical quality attributes for data-driven decision making.
- Translational Research: Bridges benchtop process development with disease-relevant preclinical models.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable workflow for diverse anchorage-dependent cell types and indications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in cell product quality and potency.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible cell expansion with tight environmental control.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces risk of late-stage biological failure.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of cell therapy candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bioreactor operation and anchorage-dependent cell culture.
- Demands access to microbioreactor instrumentation and inline environmental monitoring systems.
- Necessitates cross-team standardization of process parameters and quality metrics.
- Adaptable to various cell sources with process-specific optimization.
- Physical scale and throughput may limit direct translation to large-scale manufacturing without further scale-up.
