Onderzoek naar eiwit-glycaaninteracties: vooruitgang in nucleaire magnetische resonantie
26 augustus 2025
Dit op NMR gebaseerde protocol onderzoekt zwakke eiwit-glycaaninteracties met behulp van cyanovirine-N en D-mannose. Door ligand- en eiwitgedetecteerde methoden te combineren, brengt het bindingsplaatsen in kaart, detecteert het allosterische effecten en identificeert het ontmoetingscomplexen. De aanpak schetst monstervoorbereiding en gegevensanalyse en biedt structurele en dynamische inzichten die waardevol zijn voor glycaanspecifieke diagnostiek en herkenningsmechanismen.
We bestuderen eiwit-eiwit- en eiwit-glycan-interacties, met een focus op het integrine-disintegrine complex. Ons model onderzoekt structurele dynamica en benadrukt de rol van oppervlaktekrachten bij het mediëren van complexvorming en interactiestabiliteit. Onze groep is toegewijd aan het onderzoek naar de rol van oppervlaktekrachten in moleculaire herkenning en de evolutie van bindingsplaatsen door het bestuderen van hydrofobe clusters op het oppervlak van eiwitten.
NMR-oplossing maakt de detectie van eiwitinteracties mogelijk. Hoewel zwakke interacties essentieel zijn voor het leven, is er een voorkeur voor hoge-affiniteit complexen, ook al zijn ze aanwezig in veel belangrijke biologische functies. Onze groep richt zich op het gebruik van integratieve structurele biologie-benaderingen om grote eiwitcomplexen te bestuderen.
We gebruiken NMR als het belangrijkste hulpmiddel om dynamica en functionele aspecten te bestuderen. Om te beginnen, bereid een vier millimolair oplossing van D-mannose in natriumfosfaatbuffer met een pH van 7,4 met 50 millimolair natriumchloride en 5% deuteriumoxide. Verdeel de oplossing in twee monsters, één bevattend 80 micromolair CVN en de tweede zonder.
Voor het in kaart brengen van ligandbinding door chemische verschuivingsstoornis op het NMR-spectrometer, zet de HSQCTOPSI-pulssequentie op voor H1C13 HSQC-acquisitie. Configureer de tijdsdomein, de spectrale breedte, de draagfrequentie en het aantal scans. Bereken de chemische verschuivingsstoornis met behulp van de verstrekte vergelijking.
Om ligandbinding in kaart te brengen door verzadigingsoverdrachtsverschil, creëer eerst een nieuw dataset. Configureer de parameters voor STD NMR-experimenten door het screenen van verschillende verzadigingsfrequenties of het fixeren van de frequentie terwijl verzadigingstijden variëren om de opbouw te evalueren. Zet 1D H1 NMR-experimenten op met behulp van de ZGPR-pulssequentie.
Stel de spectrometer in voor H1, voer shimming uit en meet een harde 90-graads puls. Centreer de draagfrequentie ongeveer op 4,7 delen per miljoen, overeenkomend met het watersignaal, selecteer vervolgens de STDDIFFESGP. 3-pulssequentie en stel de acquisitieparameters in.
Stel de spectrale breedte in zoals vereist, interscan-vertraging D1 tot vier seconden, en definieer verzadigingstijd D20, volgens de experimentdoelen. Laad de FQ2-lijst met off-resonantiefrequentie bij min 40 delen per miljoen en on-resonantiefrequenties om alleen het eiwit te verzadigen. Test de on-resonantiefrequenties van min 0,59, 0,73 en 8,1 delen per miljoen om de optimale omstandigheden te bepalen.
Gebruik de optimale frequentie om STD-spectra te verwerven bij verzadigingstijden van 0,5, een, 1,5, twee, 2,5, drie en vier seconden. Plot de corresponderende ASTD-waarden als functie van verzadigingstijd. Stel het aantal scans nu in op 64 en gemiddel de experimentloop vier keer.
Stel vervolgens het totale aantal scans in. Zet de interscan-vertraging in op vier seconden en de acquisitietijd op 2,7262976 seconden. Configureer de verzadigingspuls door de duur in te stellen op 50 milliseconden en controleer de Gaussiaanse vorm via het gevormde programma 9SP9.
Pas een T1-rijfilter toe in STD NMR-variant, stel vervolgens de spinlocktijd D29 in op basis van de eiwitgrootte. Om de ligandbinding H1 R2 in kaart te brengen, selecteer eerst het CPMG_ESGP2D-pulsprogramma uit de Bruker-standaardbibliotheek. Stel het experiment in als een 2D-acquisitie.
Configureer de acquisitieparameters zoals getoond. Voer vervolgens het experiment uit gedurende 200 cycli van elk acht scans. Pas de variabele tellerlijst aan volgens de gewenste totale tijd van de CPMG-cyclus.
Voer twee experimenten uit, een voor het monster met het eiwit en een voor het ligand-alleenmonster. Plot de H1-spectra voor elke TCPMG met behulp van de opdracht EFP of sinus M gevolgd door FP, en pas vervolgens de vensterfunctie aan volgens de beste verwerkingsstrategie. Bereken de CPMG-quotiënt Q met behulp van de vergelijking.
Verwerf H1N15HSQC-spectra van N15-gelabeld CVN bij 298 Kelvin. Titreer met D-mannose om de eindconcentraties nul, een, twee, vijf, 10, 20, 40 en 60 millimol te bereiken. Gebruik de fasegevoelige FHSQCF3GPPH fast HSQC-pulssequentie uit de Bruker-standaardbibliotheek.
Bereken vervolgens de chemische verschuivingsstoornis met behulp van de formule. Plot CSP-waarden voor elk residu als functie van D-mannoseconcentratie om de dissociatieconstante KD te bepalen met behulp van vergelijking vijf. Pas vervolgens de resulterende gegevens aan op een enkele bindingsisotherm met behulp van de formule.
Gebruik de fasegevoelige HSQCT2ETF3GPSI3D-pulssequentie en configureer de parameters zoals getoond om de N15 R2-waarden van de individuele residuen van CVN-residuen in afwezigheid en aanwezigheid van 60 millimolair D-mannose bij 298 Kelvin te meten. Verwerk pseudo-driedimensionale spectra met behulp van NMRPipe om HSQC-achtige spectra voor elke relaxatievertraging te genereren. Importeer de verwerkte spectra in een analyseplatform.
Selecteer vervolgens alle spectra en pas het volgende intensiteitsveranderingen-gereedschap toe. Plot de intensiteit van elke kruispiek als functie van T-relax en pas de afname aan op een mono-exponentiële functie om N15 R2-waarden voor elk residu te extraheren. Bereken de experimentele fout aan de hand van het signaal-ruisverhouding van de HSQC-achtige spectra bij 67,84 milliseconden.
Verwerk een regio van het spectrum dat alleen ruis bevat en converteer het naar een tekstbestand met behulp van de gegeven opdracht. Bepaal vervolgens de standaardafwijking van de ruisregio of ruisintensiteit met behulp van statistische software. Bereken de experimentele fout met behulp van de gegeven vergelijking.
Chemische verschuivingsstoornissen werden waargenomen voor beide anomere vormen van D-mannose in aanwezigheid van CVN, met grotere verschuivingen in bèta-D-mannose, wat een voorkeursbinding aangeeft. Twee verschillende pieken werden
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie onderzoekt proteïne-glycaaninteracties, met de nadruk op het integrine-disintegrinecomplex. Er wordt gekeken naar de structurele dynamiek en de rol van oppervlaktekrachten bij het mediëren van de vorming en stabiliteit van het complex.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Biochemie
- Structurele biologie
Achtergrond
- Zwakke eiwitinteracties zijn cruciaal voor biologische functies.
- Er is een voorkeur voor het bestuderen van complexen met een hoge affiniteit.
- Oppervlaktekrachten spelen een belangrijke rol bij moleculaire herkenning.
- Hydrofobe clusters in eiwitten beïnvloeden de evolutie van bindingsplaatsen.
Doel van de studie
- Om de dynamiek van eiwit-glycaaninteracties te onderzoeken.
- Om de rol van oppervlaktekrachten bij de stabiliteit van interacties te begrijpen.
- Om NMR te gebruiken voor het detecteren van zwakke eiwitinteracties.
Gebruikte methoden
- NMR-gebaseerde technieken voor het bestuderen van interacties.
- Mapping van bindingsplaatsen en detectie van allosterische effecten.
- Protocollen voor monstervoorbereiding en data-analyse.
- Integratie van structureel biologische benaderingen.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van encounter-complexen in eiwit-glycaaninteracties.
- Inzichten in structurele en dynamische aspecten van binding.
- In kaart brengen van allosterische effecten in de bestudeerde complexen.
- Waardevolle informatie voor glycaan-specifieke diagnostiek.
Conclusies
- De studie vergroot het begrip van zwakke interacties in de biologie.
- Het biedt een kader voor toekomstig onderzoek naar moleculaire herkenning.
- De bevindingen hebben implicaties voor mechanismen van glycaanherkenning.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Interacties tussen eiwitten en glycanen zijn cruciaal voor cel-signalering, immuunherkenning en ziekteprogressie, maar hun zwakke en kortstondige aard vormt een aanzienlijke uitdaging voor de ontdekking van geneesmiddelen en de ontwikkeling van biomarkers. Geavanceerde NMR-protocollen maken nu mapping op atoomniveau van deze interacties mogelijk, wat bijdraagt aan voorspellende zekerheid bij targetvalidatie en mechanistische risicoreductie in vroege discovery-fasen. Deze mogelijkheid verbetert de besluitvorming over portfolio's door bindingevents met een lage affiniteit te onthullen die vaak over het hoofd worden gezien door traditionele screeningmethoden.
Strategische Toepassingen in Biopharma R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt onderzoek op atomair niveau van eiwit-glycaan-herkenningsplaatsen mogelijk voor functionele doelwitvalidatie.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door onderscheid te maken tussen regio's met een hoge en lage affiniteit binnen kandidaat-doelwitten.
- Faciliteert de identificatie van allosterische effecten en encounter-complexen die relevant zijn voor biologische signaleringspaden.
- Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid voor het verder ontwikkelen van glycaan-gerichte assets in de discovery-pipeline.
Screening & assay-ontwikkeling
- Biedt gestandaardiseerde, reproduceerbare NMR-gebaseerde assays voor het kwantificeren van zwakke eiwit-glycaaninteracties.
- Levert kwantitatieve resultaten, zoals chemische verschuivingsperturbaties en dissociatieconstanten, voor een robuuste assayontwikkeling.
- Maakt detectie van transiënte complexen met een lage affiniteit mogelijk, waardoor het bereik van screeningcampagnes wordt uitgebreid.
- Ondersteunt hergebruik van het platform voor diverse glycaanbindende eiwitdoelen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelevante glycaan-biomarkers voor translationele continuïteit van ontdekking naar preklinische validatie.
- Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk door de biologische relevantie van zwakke interacties te verduidelijken.
- Ondersteunt de identificatie van nieuwe diagnostische markers op basis van glycaan-specifieke herkenning.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit NMR-protocol is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie tot assayontwikkeling en translationeel onderzoek, en biedt een herbruikbaar platform voor het karakteriseren van proteïne-glycaaninteracties.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten en de verduidelijking van signaalpaden door het in kaart brengen van bindingsplaatsen en interactiedynamiek.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor het vergelijken van ligandaffiniteiten en bindingsmodi.
- Analytics: Levert gegevens over chemische verschuiving, relaxatie en verzadigingsoverdracht voor een robuuste statistische analyse.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt moleculaire herkenningsgebeurtenissen met ziekterelateerde biomarkers en diagnostische strategieën.
- Enterprise Hergebruik: Biedt een gestandaardiseerde workflow die aanpasbaar is aan meerdere eiwit-glycaansystemen binnen R&D-programma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van assays voor zwakke interacties.
- Strategische waarde: Maakt betere go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie mogelijk door de relevantie van binding met lage affiniteit te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van glycaan-gerichte assets.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in NMR-spectroscopie en structurele biologie voor de uitvoering van het protocol en de interpretatie van de gegevens.
- Vereist toegang tot NMR-instrumentatie met een hoog veld en geavanceerde analytische software voor spectrale verwerking.
- Vereist nauwkeurige monsterpreparatie en concentratiecontrole voor reproduceerbare resultaten.
- Kan aanpassing van acquisitieparameters vereisen voor verschillende eiwit-glycaan-systemen of bindingsaffiniteiten.
- Beperkt door de gevoeligheid en doorvoersnelheid van NMR in vergelijking met high-throughput screeningplatforms.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:12
Mapping Ligand‐Protein Interactions Using Chemical Shift Perturbation, Saturation Transfer Difference, and Relaxation NMR Techniques
5:28
Mapping the Binding of D‐Mannose on CVN by Chemical Shift Perturbation of the Protein
6:26
Mapping the Binding of D‐Mannose on CVN via the 15N‐R2 Position of the Protein
7:58
Results
