Name: Onderzoek naar eiwit-glycaaninteracties: vooruitgang in nucleaire magnetische resonantie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Ontdek hoe NMR-technieken zwakke eiwit-glycaaninteracties onthullen, met focus op het integrine-disintegrinecomplex. Deze methode biedt inzicht in structurele dynamiek en moleculaire herkenning.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

```html
<table><tbody><tr><td>13C Glucose</td><td>Cambrige Isotopic Lab.</td><td>CLM-481</td><td></td></tr><tr><td>15N Ammonium Chloride</td><td>Cambrige Isotopic Lab.</td><td>NLM-467</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel inhibit protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>Cambrige Isotopic Lab.</td><td>DLM-4</td><td></td></tr><tr><td>D-Mannose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2069-5G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>NMRPipe</td><td></td><td></td><td>Link naar de software-tutorial: https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/demo.html</td></tr><tr><td>Potassium Chloride (K2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Shigemi tube</td><td>Bruker</td><td>Z1Z10684A</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>567545</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate (NaH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S97263</td><td></td></tr><tr><td>Spectrometer Bruker 600 MHz</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrometer Bruker 800 MHz</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tiamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1270</td><td></td></tr><tr><td>Triple resonance TXI probe</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93657</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625</td><td></td></tr></tbody></table>
```

onderzoek naar eiwit-glycaaninteracties: vooruitgang in nucleaire magnetische resonantie

Exploring Protein-Glycan Interactions: Advances in Nuclear Magnetic Resonance

Onderzoek naar eiwit-glycaaninteracties: vooruitgang in nucleaire magnetische resonantie

Protein-glycan interactions are central to many biological processes and are increasingly recognized as promising targets for diagnostic strategies in ...

We bestuderen eiwit-eiwit- en eiwit-glycan-interacties, met een focus op het integrine-disintegrine complex. Ons model onderzoekt structurele dynamica en benadrukt de rol van oppervlaktekrachten bij het mediëren van complexvorming en interactiestabiliteit. Onze groep is toegewijd aan het onderzoek naar de rol van oppervlaktekrachten in moleculaire herkenning en de evolutie van bindingsplaatsen door het bestuderen van hydrofobe clusters op het oppervlak van eiwitten.NMR-oplossing maakt de detectie van eiwitinteracties mogelijk. Hoewel zwakke interacties essentieel zijn voor het leven, is er een voorkeur voor hoge-affiniteit complexen, ook al zijn ze aanwezig in veel belangrijke biologische functies. Onze groep richt zich op het gebruik van integratieve structurele biologie-benaderingen om grote eiwitcomplexen te bestuderen.We gebruiken NMR als het belangrijkste hulpmiddel om dynamica en functionele aspecten te bestuderen. Om te beginnen, bereid een vier millimolair oplossing van D-mannose in natriumfosfaatbuffer met een pH van 7,4 met 50 millimolair natriumchloride en 5% deuteriumoxide. Verdeel de oplossing in twee monsters, één bevattend 80 micromolair CVN en de tweede zonder.Voor het in kaart brengen van ligandbinding door chemische verschuivingsstoornis op het NMR-spectrometer, zet de HSQCTOPSI-pulssequentie op voor H1C13 HSQC-acquisitie. Configureer de tijdsdomein, de spectrale breedte, de draagfrequentie en het aantal scans. Bereken de chemische verschuivingsstoornis met behulp van de verstrekte vergelijking.Om ligandbinding in kaart te brengen door verzadigingsoverdrachtsverschil, creëer eerst een nieuw dataset. Configureer de parameters voor STD NMR-experimenten door het screenen van verschillende verzadigingsfrequenties of het fixeren van de frequentie terwijl verzadigingstijden variëren om de opbouw te evalueren. Zet 1D H1 NMR-experimenten op met behulp van de ZGPR-pulssequentie.Stel de spectrometer in voor H1, voer shimming uit en meet een harde 90-graads puls. Centreer de draagfrequentie ongeveer op 4,7 delen per miljoen, overeenkomend met het watersignaal, selecteer vervolgens de STDDIFFESGP. 3-pulssequentie en stel de acquisitieparameters in.Stel de spectrale breedte in zoals vereist, interscan-vertraging D1 tot vier seconden, en definieer verzadigingstijd D20, volgens de experimentdoelen. Laad de FQ2-lijst met off-resonantiefrequentie bij min 40 delen per miljoen en on-resonantiefrequenties om alleen het eiwit te verzadigen. Test de on-resonantiefrequenties van min 0,59, 0,73 en 8,1 delen per miljoen om de optimale omstandigheden te bepalen.Gebruik de optimale frequentie om STD-spectra te verwerven bij verzadigingstijden van 0,5, een, 1,5, twee, 2,5, drie en vier seconden. Plot de corresponderende ASTD-waarden als functie van verzadigingstijd. Stel het aantal scans nu in op 64 en gemiddel de experimentloop vier keer.Stel vervolgens het totale aantal scans in. Zet de interscan-vertraging in op vier seconden en de acquisitietijd op 2,7262976 seconden. Configureer de verzadigingspuls door de duur in te stellen op 50 milliseconden en controleer de Gaussiaanse vorm via het gevormde programma 9SP9.Pas een T1-rijfilter toe in STD NMR-variant, stel vervolgens de spinlocktijd D29 in op basis van de eiwitgrootte. Om de ligandbinding H1 R2 in kaart te brengen, selecteer eerst het CPMG_ESGP2D-pulsprogramma uit de Bruker-standaardbibliotheek. Stel het experiment in als een 2D-acquisitie.Configureer de acquisitieparameters zoals getoond. Voer vervolgens het experiment uit gedurende 200 cycli van elk acht scans. Pas de variabele tellerlijst aan volgens de gewenste totale tijd van de CPMG-cyclus.Voer twee experimenten uit, een voor het monster met het eiwit en een voor het ligand-alleenmonster. Plot de H1-spectra voor elke TCPMG met behulp van de opdracht EFP of sinus M gevolgd door FP, en pas vervolgens de vensterfunctie aan volgens de beste verwerkingsstrategie. Bereken de CPMG-quotiënt Q met behulp van de vergelijking.Verwerf H1N15HSQC-spectra van N15-gelabeld CVN bij 298 Kelvin. Titreer met D-mannose om de eindconcentraties nul, een, twee, vijf, 10, 20, 40 en 60 millimol te bereiken. Gebruik de fasegevoelige FHSQCF3GPPH fast HSQC-pulssequentie uit de Bruker-standaardbibliotheek.Bereken vervolgens de chemische verschuivingsstoornis met behulp van de formule. Plot CSP-waarden voor elk residu als functie van D-mannoseconcentratie om de dissociatieconstante KD te bepalen met behulp van vergelijking vijf. Pas vervolgens de resulterende gegevens aan op een enkele bindingsisotherm met behulp van de formule.Gebruik de fasegevoelige HSQCT2ETF3GPSI3D-pulssequentie en configureer de parameters zoals getoond om de N15 R2-waarden van de individuele residuen van CVN-residuen in afwezigheid en aanwezigheid van 60 millimolair D-mannose bij 298 Kelvin te meten. Verwerk pseudo-driedimensionale spectra met behulp van NMRPipe om HSQC-achtige spectra voor elke relaxatievertraging te genereren. Importeer de verwerkte spectra in een analyseplatform.Selecteer vervolgens alle spectra en pas het volgende intensiteitsveranderingen-gereedschap toe. Plot de intensiteit van elke kruispiek als functie van T-relax en pas de afname aan op een mono-exponentiële functie om N15 R2-waarden voor elk residu te extraheren. Bereken de experimentele fout aan de hand van het signaal-ruisverhouding van de HSQC-achtige spectra bij 67,84 milliseconden.Verwerk een regio van het spectrum dat alleen ruis bevat en converteer het naar een tekstbestand met behulp van de gegeven opdracht. Bepaal vervolgens de standaardafwijking van de ruisregio of ruisintensiteit met behulp van statistische software. Bereken de experimentele fout met behulp van de gegeven vergelijking.Chemische verschuivingsstoornissen werden waargenomen voor beide anomere vormen van D-mannose in aanwezigheid van CVN, met grotere verschuivingen in bèta-D-mannose, wat een voorkeursbinding aangeeft. Twee verschillende pieken werden

exploring-protein-glycan-interactions-advances-nuclear-magnetic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

This video describes the nuclear magnetic resonance spectroscopy technique to study protein-protein interactions between 15N-labeled wild-type and mutant envoplakin proteins and the unlabeled vimentin protein. The successful interaction between wild-type envoplakin and vimentin leads to extensive line broadening and peak disappearance in the NMR spectra, whereas the absence of an interaction between the mutated envoplakin and vimentin results in well-resolved peaks in the NMR spectra.

Nuclear Magnetic Resonance to Study Atomic Level Protein-Protein Interactions

Structuren van supramoleculaire eiwit samenstellingen met atomaire resolutie zijn van groot belang vanwege hun cruciale rol in een verscheidenheid van biologische fenomenen. Hierin presenteren wij een protocol voor het uitvoeren van high-resolution structurele studies op onoplosbare en niet-kristallijne macromoleculaire eiwit samenstellen door magie-angle spinning solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (MAS SSNMR).

Atoomschaal structurele Studies van macromoleculaire samenstellen door Solid-state nucleaire magnetische resonantie spectroscopie

Hier presenteren we een protocol voor de productie en zuivering van eiwitten die zijn gemarkeerd met stabiele isotopen, en verdere karakterisering van eiwit-eiwitinteractie met behulp nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie en MicroScale Thermophoresis (MST) experimenten.

Meten van interacties van bolvormige en filamenteuze eiwitten door nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (NMR) en Microscale Thermophoresis (MST)

Dit protocol illustreert hoe menselijke eiwitglyomen kunnen worden verkend, vergeleken en geïnterpreteerd met online bronnen.

Bioinformatica Bronnen voor de Studie van Glycan-Gemedieerde Eiwit Interacties

Hier presenteren we een protocol waarin de verwerving, verwerking en analyse van een reeks NMR-experimenten wordt beschreven die gericht zijn op het karakteriseren van eiwit-glycaaninteracties in oplossing. De meest voorkomende op liganden gebaseerde en op eiwitten gebaseerde methodologieën worden geschetst, die ongetwijfeld bijdragen aan de gebieden van structurele glycobiologie en moleculaire herkenningsstudies.

Ontwarren van glycaan-eiwitinteracties: nucleaire magnetische resonantie (NMR) om te redden

We beschrijven hier een methode om meerdere fosforylaties van een intrinsiek ongeordend eiwit te identificeren door middel van Kernspinresonantiespectroscopie (NMR), met behulp van het Tau-eiwit als casestudie. Recombinant Tau wordt isotopisch verrijkt en gemodificeerd in vitro door een kinase voorafgaand aan gegevensverwerving en analyse.

Nucleaire magnetische resonantie spectroscopie voor de identificatie van verschillende fosforyleringen van intrinsiek ontvouwen eiwitten

Conformationele flexibiliteit speelt een cruciale rol in de eiwit-functie. Hierin beschrijven we het gebruik van tijdsopgeloste electrospray ionisatie massaspectrometrie gekoppeld met waterstof deuterium ruil voor het sonderen van de snelle structurele veranderingen die functie rijden besteld en ontvouwen eiwitten.

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Een protocol voor het voorbereiden van 13C,15N-geëtiketteerden schimmel en plant monsters voor multidimensionale Solid state NMR spectroscopie en dynamische nucleaire polarisatie (DNP) onderzoeken wordt gepresenteerd.

Voorbereiding van schimmel en plantaardig materiaal voor structurele opheldering met behulp van dynamische nucleaire polarisatie Solid state NMR

Interacties van transcriptiefactoren (TFs) met de RNA-polymerase worden meestal bestudeerd met behulp van keuze assays. We passen een Biolayer interferometrie (BLI) technologie toe om de interactie van GrgA met de chlamydiale RNA-polymerase te karakteriseren. Vergeleken met keuze assays, bli detecteert real-time associatie en dissociatie, biedt een hogere gevoeligheid, en is zeer kwantitatief.

Toepassing van Biolayer interferometrie (BLI) voor het bestuderen van eiwit-eiwit interacties in transcriptie

Hier is een protocol voor het onderzoek van de interacties tussen inheemse vorm, prefibrillar, en volwassen amyloïde fibrillen van verschillende peptiden en eiwitten met mitochondriën geïsoleerd uit verschillende weefsels en verschillende gebieden van de hersenen.

Interacties met en membraan Permeabilization van de mitochondriën van de hersenen door amyloid fibrils

Ontdek hoe NMR-technieken zwakke eiwit-glycaaninteracties onthullen, met focus op het integrine-disintegrinecomplex. Deze methode biedt inzicht in structurele dynamiek en moleculaire herkenning.

Onderzoek naar eiwit-glycaaninteracties: vooruitgang in nucleaire magnetische resonantie

Meer video's verkennen