Verbeterde genoombewerking via oviductale nucleïnezuren Op levering gebaseerde in vivo elektroporatietechniek voor het genereren van knock-out muizen

De scope van ons onderzoek is het vereenvoudigen van de generatie van knockoutmuizen door gebruik te maken van in utero elektroporatie, waarbij genoombewerkingscomponenten direct in de eierleiders van zwangere vrouwen worden afgeleverd. Micro-injecties in zygoten vereisen het onderhouden van een groot aantal dieren, waaronder donor- en ontvangervrouwtjes en gevasectomiseerde mannetjes. Daarom zijn protocollen die het gebruik van dieren minimaliseren te verkiezen.

Het gebruik van het Nepa21-systeem voor zygote elektroporatie biedt een unieke kans om gerichte gen-knockoutmuizen in één stap te genereren, met een efficiëntie vergelijkbaar met standaard nucleaire injectietechnieken. Om te beginnen gebruik computationele analysetools om potentiële single guide RNA-sequenties te identificeren die gericht zijn op het geselecteerde gen van belang. Selecteer sequenties die in exonen liggen en zo dicht mogelijk bij de gewenste mutatieplaats liggen. Gebruik een genoombrowser om exoomstructuren te vergelijken en prioriteer sequenties die aanwezig zijn in de meeste splice-isoformen.

Analyseer de voorspelde off-target activiteit van elke guidesequentie met behulp van het geïntegreerde scoresysteem van de tool. Kies sequenties die de laagste kans op off-target binding aantonen. Om een lineair dubbelstrengs DNA-sjabloon te produceren, bereid je de PCR-mastermix voor met behulp van de componenten die in de gegeven tabel zijn gespecificeerd.

Voeg de polymerase als laatste toe en houd het hoofdmengsel op ijs om de enzymatische stabiliteit te behouden. Voer vervolgens de PCR uit met de volgende thermische cycluscondities. Vervolgens bereid je de in vitro transcriptie-meestermix voor met de gegeven componenten en incubeer je de reactie 1,5 uur bij 37 graden Celsius met een thermocycler voor consistente temperatuurregeling.

Voeg vervolgens twee microliter DNase I toe aan de reactie. Incubeer bij 37 graden Celsius nog eens 30 minuten om het DNA-sjabloon te verteren, en inactiveer het enzym vervolgens bij 75 graden Celsius gedurende vijf minuten. Na de TRIzol-zuivering van RNA meet u de RNA-concentratie met een spectrofotometer en controleert u de A260 tot A280 en A260 tot A230 verhoudingen.

Om het ribonucleoproteïnecomplex voor transfectie voor te bereiden, verdun je één molaire Tris-HCl-buffer tot een concentratie van 100 millimolair met nucleasevrij water. Filter de oplossing met een spuitfilter met een poriegrootte van 0,022 micrometer. Aliquot in porties van 10 microliter en bewaren bij vier graden Celsius tot gebruik.

Vervolgens bereid je het transfectiemengsel voor met spCas9-nuclease, enkel geleide-RNA en Tris-HCl, verdund met DEPC-water in een nucleasevrije buis. Incubeer het transfectiemengsel bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten om de vorming van het ribonucleoproteïnecomplex mogelijk te maken. Aliquot vervolgens het transfectiemengsel in kleine volumes die geschikt zijn voor enkele I-GONAD-sessies en houd deze op vier graden Celsius om de reagensactiviteit te behouden.

Na het paren van CD1-vrouwtjes met eenhuisige CD1-mannelijke muizen gedurende de nacht, controleer je elk vrouwtje op de aanwezigheid van een paringsplug. Breng alleen die vrouwtjes met zichtbare pluggen over in een nieuwe kooi voor verdere experimentele procedures. Autoclave alle roestvrijstalen chirurgische instrumenten om sterilisatie vóór gebruik te waarborgen.

Weeg vervolgens de geselecteerde plug = positieve vrouwelijke muizen met een elektronische weegschaal voordat je ze onder narcose plaatst. Houd de verdoofde muizen in de gaten op verlies van de teenpnijpreflex om voldoende verdoving te bevestigen. Plaats de muis op een warmtekussen om tijdens de procedure de lichaamstemperatuur te behouden.

Breng vervolgens veterinaire zalf aan op de ogen om droogheid te voorkomen. Maak met een fijne schaar een lengtesnede van 0,7 centimeter in de huid van het onderruggebied. Vervolgens spreid je de licht open punten van de schaar lateraal om de huidincisie voorzichtig uit te breiden tot ongeveer 1,3 centimeter.

Maak daarna voorzichtig een incisie van 0,7 centimeter in het buikholte om de buikholte bloot te leggen. Verleng de peritoneale incisie tot 1,1 centimeter, waarbij je biderdig duwt met licht open schaarpunten. Zoek het vetkussen dat aan de eierstok is verbonden en trek het voorzichtig naar buiten met een tang totdat de eierstok, eileider en baarmoeder blootliggen.

Met een vatklem bevestig je het vetkussen om de voortplantingsstructuren te stabiliseren. Vervolgens laad je twee microliter van het ribonucleoproteïne-injectiemengsel in een wegwerpplastic capillair met een stripper pipetter. Maak met een microschaar een incisie van 0,2 centimeter in de wand van de eileider, enkele millimeters stroomopwaarts van de ampulla.

Breng de plastic capillair die aan de stripper-pipetter is bevestigd in de incisie van de eileider en voer het injectiemengsel voorzichtig uit zonder lucht toe te voegen. Haal voorzichtig de plastic capillair uit de eileider om de injectie te voltooien. Zet de elektroporator aan door op de aan/uit-schakelaar op het frontpaneel te drukken.

Stel de elektroporatieparameters in op het apparaat zoals op het scherm weergegeven. Met pincetelektroden pak je voorzichtig het eileider vast en druk je op de Kiloohm-knop om de weerstand te meten. Direct na de weerstandmeting druk je op de Startknop om elektroporatie te starten en wacht je tot het eindsignaal op de Ohm-knop verschijnt.

Na de elektroporatie van de eerste eileider wordt het voortplantingskanaal voorzichtig teruggebracht naar de buikholte. Sluit de incisie met 4-0 polyglycolzuur chirurgische hechting. Voor genotypering ontwerp je 18 tot 21 nucleotide lange primers met een smelttemperatuur van bijna 60 graden Celsius om een PCR-product van 300 tot 600 basen te genereren.

Om de specificiteit van elke primer te bevestigen, voer je een BLAST-zoekopdracht uit in de muizengenoomdatabase om het risico op niet-specifieke amplificatie te elimineren. Vervolgens verzamel je voor DNA-extractie met een oorpunch een klein weefselmonster van ongeveer twee millimeter van het oor van de muis. Voeg 100 microliter lysisbuffer toe.

Incubeer het monster 60 minuten bij 95 graden Celsius en laat het elke 20 minuten vortexen om efficiënte lysie te garanderen. Na het uitvoeren van Sanger-sequencing analyseer je de resultaten om de resultaten van genoombewerkingen te beoordelen. Om ICE-analyse te gebruiken, upload je beide Sanger-sequencingbestanden, voer je de geleidelijke RNA-sequentie in en selecteer je de juiste nuclease die in het CRISPR-experiment is gebruikt.

Vervolgens uploadt u om TIDE de controle- en experimentele sequencingbestanden in AB1-formaat te gebruiken en voert u de geleide-RNA-sequentie in. ICE-analyse detecteerde drie verschillende indelvarianten op de Cas9-cutplaats: een verwijdering van één basenpaar in 42% van de sequenties, een verwijdering van drie basenparen in 25% van de sequenties en een deletie van 23 basenpaar in 27% van de sequenties. De modelfitwaarde was 0,94 en de knockoutscore was 69, wat wijst op een sterke voorspelde correlatie en waarschijnlijk genknockout.

Sequentiechromatogrammen bevestigden verstoring op de Cas9-snijplaats in het bewerkte monster, terwijl het controlechromatogram een intacte sequentie op dezelfde plaats liet zien. Van de zes elektroporatiemuizen produceerden er slechts vier jongen met mutaties, wat resulteerde in een totale bewerkingsefficiëntie van 60%. Alle nestjes van de zes elektroporatiemuizen lieten minder welpen zien, met slechts drie tot vier jongen per muis.