Verbetering van chimere antigeenreceptor-extracellulaire blaasjes (CAR-EV) -technologie: de toekomst van kankertherapie

Ons onderzoek richt zich op de ontwikkeling van op exosomen gebaseerde diagnostiek en therapieën. Een doel is het ontwikkelen van op exosomen gebaseerde therapieën op basis van chimere antigeenreceptoren, die veiliger, effectiever en toegankelijker zijn dan celgebaseerde therapieën, voor de behandeling van zijtumoren. Onze EXO-NET- en EXO-ACE-platforms maken schaalbare, reproduceerbare en GMP-conforme exosoomisolatie mogelijk met een hoge opbrengst en zuiverheid, waarmee we de beperkingen van traditionele methoden voor onderzoek en therapieën aanpakken.

EXO_NET net en EXO-ACE maken snelle, schaalbare en GMP-conforme EV-isolatie mogelijk, met superieure zuiverheid en reproduceerbaarheid, en presteren beter dan centrifugatie en precipitatie voor onderzoek, diagnostiek en therapeutische toepassingen. We hebben een snelle, schaalbare en gevalideerde methode ontwikkeld om CAR-EV's te ontwikkelen en celvrije, gerichte therapieën van de volgende generatie te leveren. Dit biedt een robuuste workflow die kan worden toegepast op andere ziektetoestanden waar een klinische behoefte aan is.

Ons volgende doel is om de methoden die we hebben ontwikkeld en gevalideerd te gebruiken om CAR-EV's te genereren voor de toediening van RNA-therapieën voor de behandeling van solide tumoren en andere ontstekingsziekten. Breng om te beginnen de ionenuitwisselingskolom op kamertemperatuur door deze 15 minuten rechtop te laten staan. Voeg met behulp van een pipet 10 kolomvolumes regeneratiebuffer toe, gevolgd door 10 kolomvolumes evenwichtsbuffer.

Haal het THOD-geconditioneerde medium door een polyethersulfonfilter van 0,22 micrometer. Voeg nu maximaal 31,2 kolomvolumes van het gefilterde monster toe aan de gebalanceerde kolom. Voeg vervolgens 10 kolomvolumes wasbuffer toe, gevolgd door 2,5 kolomvolumes elutiebuffer.

Verzamel de doorstroming met de verrijkte extracellulaire blaasjes. Gebruik centrifugaalfilters van 30 kilodalton ultrafiltratie en een verdunningsmiddel om bufferuitwisseling uit te voeren op het extracellulaire blaasjeselute, waarbij een minimale 100-voudige verdunning wordt gegarandeerd. Pas het uiteindelijke volume van de uitgewisselde oplossing aan op basis van de experimentele behoeften.

Haal het verrijkte extracellulaire blaasjesmonster door een filter van 0,22 micrometer om het te steriliseren voor in-vitro-testen. Bepaal de grootteverdeling, concentratie en opbrengst van extracellulaire blaasjes van CAR met behulp van nanodeeltjesvolganalyse. Voor high-throughput pan-exosoom extracellulaire blaasjesisolatie schakelt u het instrument in en logt u in op het instrument.

Configureer de instellingen om het HT EV-eiwitisolatieprotocol tot stand te brengen. Bereid een tipkamplaat voor door een tipkam in een plaat met 96 putjes te plaatsen. Voeg een milliliter PBS toe aan elk putje om drie wasplaten voor te bereiden.

Bereid nu een elutieplaat voor door 35 microliter 1%SDS-buffer in elk putje van een plaat met 96 putjes te pipetteren. Bereid vervolgens een bindplaat voor door een milliliter van het geconditioneerde medium toe te voegen. Begin op het geautomatiseerde isolatiesysteem met het protocol door het programma HT EV Protein Isolation Protocol te selecteren en selecteer de afspeelknop.

Open het instrument om te beginnen met het laden van de platen. Volg de aanwijzingen van het instrument en laad de voorbereide elutieplaten, gevolgd door de platen met drie wasringen in diepe putjes in het instrument. Vlak voor het laden van de bindplaat, voegt u 30 microliter pan-exosoomvangkralen toe aan elk putje.

Laad de bindplaat in het instrument, laad vervolgens de tipkamplaat en sluit het instrument om het binden te starten. Het systeem mengt het geconditioneerde mediummonster en de magnetische kralen continu op lage snelheid gedurende 30 minuten, waardoor extracellulaire blaasjes efficiënt kunnen worden opgevangen. Laat het systeem na voltooiing van de bindstap drie wasstappen uitvoeren, waarbij u gedurende 30 seconden met een lage snelheid mengt om niet-specifieke verontreinigingen te verwijderen.

Laat het geautomatiseerde systeem extracellulaire vesikel lysis initiëren voor eiwitherstel door een bodemmix van 30 seconden uit te voeren. Tijdens de incubatie pauzeert het instrument zeven minuten en 30 seconden, terwijl de pipetpunten boven elk putje blijven staan. Start nog een mix van 30=seconden, gevolgd door nog een pauze van zeven minuten en 30 seconden.

Wanneer het protocol is afgelopen, tilt het systeem de gebruikte tipkam op, waardoor de oplossing in de plaat met 96 putjes achterblijft en de magnetische kralen aan de tips zijn bevestigd. Ten slotte gaat het instrument verder naar de vertrekstap en plaatst de tipkam terug in de tipkamplaat. Open het instrument en verwijder de platen.

GFP-fluorescentie bevestigde CAR-expressie in getransduceerde T-cellen, waarbij lokalisatie duidelijk zichtbaar was in celclusters en colokalisatie werd geverifieerd door helderveld- en GFP-kanalen over elkaar heen te leggen. Analyse van het volgen van nanodeeltjes onthulde een significant hogere concentratie van extracellulaire blaasjes in de verrijkte EV-fractie in vergelijking met geconditioneerde media voor zowel EGFR- als HER2 CAR-constructies. Western blotting bevestigde de aanwezigheid van granzym B in cellen die CAR tot expressie brengen en in de geïsoleerde extracellulaire blaasjes, waarbij calnexine afwezig was in de extracellulaire blaasjes, wat wijst op een gebrek aan cellulaire besmetting.

EGFR-gerichte CAR extracellulaire blaasjes verminderden de levensvatbaarheid van MCF-7-borstkankercellen significant met 70% en de levensvatbaarheid van K-562-bloedkankercellen met 40%HER2-gerichte extracellulaire blaasjes in de auto vertoonden een vermindering van ongeveer 10% van de levensvatbaarheid van MCF-7-borstkankercellen, terwijl ze geen waarneembaar effect hadden op K-562-bloedkankercellen.