Kanteerbare in vivo herprogrammering van tumorcellen tot type 1 conventionele dendritische celachtige cellen

We onderzoeken in vivo programmering van kankercellen tot cDC1-achtige cellen als een nieuwe immunotherapiestrategie. We willen bepalen of deze aanpak immuun koude tumoren kan omzetten in immuun warm, waardoor antitumorimmuniteit wordt aangekondigd. We pakken de beperkingen van de huidige in vivo cDC1-generatiestrategieën aan door een protocol voor te stellen om kankercellen direct in de tumor om te zetten in immunogene cDC1-achtige cellen, waardoor de studie van cDC1-gestuurde immuunresponsen in situ mogelijk wordt.

Ons traceerbare in vivo programmeerprotocol genereert op betrouwbare wijze rijpe immunogene cDC1-achtige cellen, die de onderdrukkende tumormicro-omgeving overwinnen, en omdat deze cellen direct in vivo worden gegenereerd, elimineert deze aanpak de noodzaak van in vitro productie van immuuncellen. Onze bevindingen leggen een basis voor het vertalen van in vivo transcriptiefactor-gemedieerde herprogrammering naar de kliniek, waarbij kant-en-klare, maar gepersonaliseerde kankerimmunotherapie wordt geïntroduceerd die duurzame antitumorimmuunresponsen opwekt. In de toekomst onderzoeken we hoe cDC1-achtige cellen die herprogrammeren de vorming van tertiaire en infrastructurele cellen kan uitlokken en of dit zich vertaalt in humorale immuniteit.

Daarnaast onderzoeken we ook de mogelijke synergie met andere immunotherapeutische benaderingen. Kweek om te beginnen de HEK 293T-cellen totdat ze een samenvloeiing van 70 tot 80% bereiken. Nu, vortex de voorbereide transfectiemengeling die het overdrachtplasmide grondig gedurende één minuut bevat en incubeer het mengsel 15 minuten bij kamertemperatuur om de complexe vorming van DNA-lipiden toe te staan.

Zuig het medium op uit de HEK 293T cellen en voeg 10 milliliter DMEM toe zonder penicilline streptomycine en aangevuld met 10%FBS. Voeg vervolgens de transfectiemix druppelsgewijs toe aan de 150 millimeterplaten en incubeer gedurende 16 uur bij 37 graden Celsius met 5%carbon dioxide. Vervang het medium na incubatie door 20 milliliter DMEM compleet medium aangevuld met één millimolair natriumbutyraat en incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide.

Verzamel vervolgens het lentivirus-bevattende supernatans in een conische buis van 50 milliliter op 48 en 60 uur na transfectie. Voeg na de eerste collectie 12 milliliter voorverwarmde complete DMEM per 150 millimeter plaat toe voor de tweede oogst. Filtreer de opgevangen vloeistof door een polyethersulfonfilter van 0,45 micrometer met een laag eiwitgehalte.

Pipetteer 37 gram van het lentivirus-bevattende medium in 38,5 milliliter open top dunwandige polypropyleen buisjes. Centrifugeer de buizen in een draaiende emmerrotor bij 25.000 G gedurende 90 minuten bij vier graden Celsius. Zuig na het centrifugeren het bovenstaande op zonder de pellet te verstoren.

Plaats de dunwandige polypropyleen buizen met open bovenkant ondersteboven op een laboratoriumdoekje of soortgelijk absorberend materiaal gedurende vijf minuten om overtollige vloeistof af te voeren en de pellet te drogen. Voeg vervolgens 200 microliter ijskoude DMEM aangevuld met HEPES of PBS toe aan elke pellet en breng het mengsel over in een microcentrifugebuis die in een conische buis van 50 milliliter wordt geplaatst. Incubeer de pellet een nacht bij vier graden Celsius om volledige resuspensie mogelijk te maken.

Combineer alle geresuspendeerde pellets in een enkele container, verdeel de virale voorraad in kleinere volumes tussen 50 en 200 microliter en bewaar bij min 80 graden Celsius voor langdurig gebruik. Bereid na de expansie van kankercellen de celsuspensies voor op transductie om op dag drie een bijna één-op-één-verhouding van EGFP-positieve en EGFP-negatieve cellen te bereiken. Voeg acht microgram per milliliter polybreen toe aan de celsuspensie, gevolgd door het juiste volume lentivirus, zoals eerder bepaald.

Meng de inhoud voorzichtig zonder bubbels te genereren. Piket nu twee milliliter van de bereide celsuspensie met één keer 10 tot de macht van vijf cellen in elk putje van een weefselkweekplaat met zes putjes en incubeer gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Verwijder na 24 uur het lentivirusbevattende medium uit elk putje.

Was de putjes twee keer met PBS. Voeg 500 microliter trypsine toe aan elk putje en incubeer gedurende vijf tot 10 minuten bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Onderzoek vervolgens de putjes onder een lichtmicroscoop om te bevestigen dat de cellen volledig zijn losgekomen van de plaat.

Verzamel vervolgens de cellen met behulp van volledige media in conische buizen van 50 milliliter. Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 350 G om ze te pelletiseren. Was de korrel met PBS.

Neem een aliquot en beoordeel het aantal levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer en trypanblauwe kleuring. Resuspendeer vervolgens de uiteindelijke celpellet in ijskoude PBS om een concentratie te bereiken van twee tot vier keer 10 tot de macht van zeven cellen per milliliter, wat overeenkomt met één tot twee keer 10 tot de macht van zes cellen in 50 microliter per tumor. Plaats de cellen op ijs en verplaats ze naar het dierproefgebied.

Nadat u de CD45.1-muis hebt verdoofd, plaatst u deze op een warmhoudkussen om onderkoeling te voorkomen. Breng oogcrème aan op de muis om uitdroging van het oog tijdens de anesthesie te voorkomen. Scheer met een scheermes de rechterflank van de muis.

Markeer de muis eventueel met een oorclipper. Desinfecteer het geschoren gebied en verwijder de resterende haren met een in 70% ethanol gedompeld wattenstaafje. Breng nu met een P1000-pipet de kankercellen grondig in suspensie.

Laad de volledig geresuspendeerde celsuspensie in een spuit van 0,5 milliliter die is uitgerust met een naald van 30 gauge. Til de huid op de geschoren flank van de muis voorzichtig op met twee vingers en steek de punt van de spuitnaald in de vouw die wordt gevormd door de opgetilde huid. Maak de gelifte huid los terwijl u de spuit met één hand op zijn plaats houdt.

Gebruik de andere hand om de bovenkant van de huid met twee vingers uit te rekken. Injecteer langzaam 50 microliter van de kankercelsuspensie om een zichtbare ovaalvormige onderhuidse zwelling op de injectieplaats te creëren. Houd het dier na de injectieprocedure in de gaten totdat het volledig ontwaakt uit de narcose om overleving te garanderen.

HEK 293T-cellen getransfecteerd met SFFV-PIB-eGFP-plasmide vertoonden 24 uur na transfectie duidelijke eGFP-expressie, wat een succesvolle plasmaafgifte bevestigt. 72 uur na transductie gaven melanoomcellen een succesvolle afgifte van de herprogrammeringsfactoren en eGFP aan. Op dag negen na de implantatie van cellen leverde in vivo herprogrammering een hoger percentage volledig geherprogrammeerde CD45-positieve, MHC-II-positieve, cDC1-achtige cellen op dan in vitro omstandigheden.

Op dag drie na de implantatie vertoonden PIB-eGFP-tumoren een duidelijk hogere CD45-positieve immuuncelinfiltratie dan eGFP-controles, wat wijst op vroege immuunremodellering. Op dag negen bleef de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van CD45 per tumorgebied significant hoger bij PIB-eGFP-tumoren dan bij controles. Tertiaire lymfoïde structuren werden op dag negen detecteerbaar in PIB-eGFP-tumoren, wat wijst op structurele immuunveranderingen in de micro-omgeving van de tumor.