SCAnED - een open-source huidsegmentatiemacro voor semi-geautomatiseerde detectie van cellen en kernen in epidermale en dermale huidcompartimenten

In ons werk onderzoeken we regulerende mechanismen die de weefselhomeostase op moleculair, cellulair, structureel en mechanisch niveau in stand houden. Ons doel is om pathologische aandoeningen te begrijpen, zoals huidontsteking of kanker. Met nieuwe hoge-resolutie beeldvormings- en multiomics-tools kunnen we nu cellulaire en genexpressieveranderingen in weefsels in 2D en 3D in kaart brengen.

Dit vergroot echt ons begrip van hoe ziekten zich ontwikkelen en zich ontwikkelen. Een van de grote uitdagingen op dit moment is de enorme hoeveelheid data die door geavanceerde microscopie wordt gegenereerd. En hoewel er meer tools beschikbaar zijn om beelden te analyseren, zijn ze vaak niet gebruiksvriendelijk voor mensen zonder veel ervaring, of behoorlijk duur.

Ons protocol biedt een gratis, gebruiksvriendelijk hulpmiddel voor het analyseren van menselijke huidcellen in zowel de epidermis als de dermis. Het verbetert de nauwkeurigheid ten opzichte van algemene tools en vereist geen codering of eerdere ervaring met beeldanalyse. Om te beginnen opent u de immunofluorescentiebeelden in Fiji of Image J, met bioformaten en de standaardinstellingen.

Splits de kanalen niet tijdens deze stap. Download de SCAnED-macro en voer deze uit door plugins te selecteren. Dan macro's en het klikken op 'run'.

Selecteer het SCAnED-macroscriptbestand wanneer daarom wordt gevraagd. Volg de instructies op het scherm die door de macro worden verstrekt. Selecteer het E-cadherin-kanaal wanneer de macro daarom vraagt.

Vervolgens navigeer je naar beeld, kies je 'aanpassen', en vervolgens drempel om handmatig de drempel voor het E-cadherine-kanaal aan te passen. Klik op OK zodra het epidermale gebied volledig is vastgelegd. Selecteer vervolgens het DAP-E-kanaal wanneer je wordt gevraagd door te gaan met segmentatie.

Definieer automatisch de intensiteitsniveaus voor kernsegmentatie bij gebruik van de drempelfunctie. Voor StarDist, open de plugin in Image J. Laad het kerndetectiemodel in de grafische interface van StarDist en klik op het kernkanaal om het te selecteren voor analyse. Pas nu de tegelinstellingen in StarDist aan om overeen te komen met de verwachte patchgrootte van 256 bij 256 pixels.

Wanneer daarom wordt gevraagd, selecteer je ja om de markerintensiteit binnen de kernen te meten. Herhaal vervolgens het segmentatie- en analyseproces voor elk fluorescentiekanaal. Nadat alle kanalen zijn verwerkt, sla je de uitvoergegevens op als comma-gescheiden waardebestanden zoals geïnstrueerd door de macro.

Voor het cytoplasmatische gebied, wanneer kernsegmentatie is uitgevoerd met behulp van de drempelfunctie, pas binaire dilatatie toe om het kerngebied van belang uit te breiden. Wanneer StarDist is gebruikt voor kernsegmentatie, pas dan de expansie-expansie toe op het kerngebied van interesse. Selecteer ja wanneer gevraagd wordt om de markerintensiteit binnen het hele celgebied te meten.

Sla vervolgens de resulterende databestanden op als komma-gescheiden waardeformaat volgens macro-instructies. Stel markerspecifieke intensiteitsdrempels vast met isotypecontrolemonsters. Download het juiste Jupyter-notitieboek en ga naar Google Collab om bestand te selecteren, gevolgd door het notitieboek te openen.

Kies het bestand en voer de codecellen sequentieel uit. Wanneer je wordt gevraagd met de optie 'bestanden kiezen', klik je op de knop en upload je het bestand met een komma gescheiden waarde. Voor elk antilichaam bereken je de gemiddelde fluorescentieintensiteit met behulp van de isotypecontrolebestanden.

Om de cutoff-drempels te bepalen, open je het dot plot notebook, upload je de isotypecontrolegegevens en voer je de code uit. Op basis van de verdeling van stippen in de grafieken voor zowel isotypecontrole als specifieke antistofgegevens, kies je een intensiteitsdrempel om achtergrondsignaal te onderscheiden van echte markerexpressie. Gebruik deze drempel om elke cel als positief of negatief te classificeren voor de gegeven marker.

Maak tenslotte puntdiagrammen om co-expressiepatronen van markers te visualiseren door de puntgrafiekcode uit te voeren in het Google Collab-notitieboek. In handmatig gesegmenteerde beelden toonden vimentine-positieve cellen een sterk cytoplasmatisch signaal met duidelijke ROI-grenzen die het hele cellichaam bedekten. De semi-geautomatiseerde segmentatie van SCAnED ving vimentine-positieve cellen met vergelijkbare grenzen met behulp van een drempel- en dilatatiebenadering.

Kwantitatieve vergelijking van vimentine-intensiteit in 21 cellen toonde geen significant verschil tussen handmatige en SCAnED-segmentatie. Histogramanalyse toonde een hogere frequentie van vimentine-positieve cellen in psoriasis dermis in vergelijking met gezonde huid. Dotplotanalyse van dermale cellen toonde een toename van CD-90 positieve vimentine-positieve cellen in psoriasis in vergelijking met een gezonde huid.

In de epidermis toonden psoriasismonsters een toename van CD-90 positieve vimentine-negatieve cellen, mogelijk keratinozyten, vergeleken met gezonde huid. Vimentine-positieve celtellingen in psoriatische en gezonde epidermis waren vergelijkbaar tussen SCAnED en QuPath. visuele segmentatie toonde aan dat SCAnED grenscellen nauwkeuriger aan de epidermis toewijst dan QuPath, dat meerdere fouten toekende.