Ontwikkeling van van muizen afgeleide organoïdelijnen van eileiderepitheelcellen voor modellering van hooggradig sereus ovariumcarcinoom

Dus ja, we werken momenteel aan het ontwikkelen van nieuwe modellen van hooggradig serous ovariumcarcinoom, modellen die syngeen zijn in de zin die het protocol beschrijft. We nemen de gezonde eileiders van gezonde muizen en halen ze vervolgens af als organoïden in de petrischaal en geven ze vervolgens alle verschillende fouten of genetische modificaties die we normaal gesproken in een normale menselijke versie van de ziekte zouden vinden. Dit is heel gaaf, want aan de ene kant kun je allerlei intrinsieke factoren van deze tumoren in de petrischaal bestuderen als organoïden, die realistischer zijn dan traditionele 2D-culturen.

Maar het punt is dat omdat er syngene modellen zijn, je deze organoïden kunt nemen en ze terug in een muis kunt plaatsen, en dan kunt zien hoe de tumor zich daadwerkelijk ontwikkelt en vervolgens met de gastheer interacteert. Dit stelt ons in staat een veel holistischer beeld te krijgen van hoe een tumor en tumorvorming daadwerkelijk ontstaan, waarvan we hopen dat dat ons veel betere tools en een veel beter begrip geeft van hoe deze ziekte werkt en hoe we het beter kunnen bestrijden. Om te beginnen, verkrijg geëuthanaseerde vrouwelijke C57 zwarte 6J muizen.

Verwijder de eierstok en eileider en breng deze over in een steriele petrischaal met DMEM, aangevuld met penicillinestreptomycine bij vier graden Celsius. Gebruik een dissectiemicroscoop, een fijne tang en een schaar om het resterende vet uit de eierstok te verwijderen. Isoleer de eileider, inclusief het infundibulum en een deel van de distale ampulla van de eierstok en baarmoeder.

Breng het gereinigde weefsel nu over in een buis met het volledige verteringsmengsel. Met een fijne schaar snijd je de eileider in stukjes kleiner dan 0,5 millimeter. Daarna incubeer je de buis op 37 graden Celsius gedurende 40 tot 50 minuten voordat organoïde wordt gekweekt.

Om het muistumormodel te ontwikkelen, stelde je vijf injecties op, elk met vier miljoen cellen die opnieuw worden opgehangen in niet-aangevulde Opti-MEM I, een ijskoude basalmembraanmatrix. Om de injecties voor te bereiden, stoot eerst luchtbellen uit het dode volume van een U-100 insulinespuit met een 28-gauge naald met koud PBS. Laad dan langzaam de spuit met 40 microliter cellen en laat de geladen spuiten op ijs tot de muizen onder narcose zijn.

Zodra ze klaar zijn voor injectie, plaats je de spuiten naast een verwarmingslamp om de membraanmatrix van de kelder op te warmen en de viscositeit te verhogen, wat de injectie en engraftment vergemakkelijkt. Plaats vervolgens een muis in een voorverwarmde kooi onder een verwarmingslamp om je voor te bereiden op de operatie. Maak een incisie van minder dan één centimeter langs de flank, boven het dij van een verdoofde muis.

Snijd door de epidermis en de hypodermis om het bursagebied te bereiken. Trek voorzichtig de eierstok eruit door het vastzittende vetkussen te vinden. Vervolgens injecteer je met een voorbereide spuit cellen via het vetkussen en de eierstok in de eierzak.

Zet de eierstok voorzichtig terug in de bursa. Sluit de spierlaag met niet-gevlochten hechtingen. Sluit vervolgens de huidincisie met chirurgische nietjes.

Plaats de muis terug in de verwarmde kooi en houd de lichaamstemperatuur met een verwarmingslamp tot hij half bewust is, meestal langer dan 15 minuten. Organoïden afkomstig van het epitheel van de muiseileider hebben na ongeveer vijf dagen een goed gedefinieerde bolvormige en heldere vorm en moeten rond dag 10 tot 12 worden verpakt. De wildtype-organoïden worden omgezet in precancereuze tumoren met behulp van genetische engineeringtechnieken, zoals lentivirale of retrovirale genexpressie.

Enkele klooncellijnen afkomstig van genetisch gemodificeerde organoïden kunnen verder in vivo worden bestudeerd door injectie in de eierstokbursa. Tumoren bereiken meestal een grootte van twee tot drie centimeter rond 60 dagen na de injectie. Nou, we zeggen dat eigenlijk, zoals ik eerder aangaf, het grootste voordeel van dit protocol natuurlijk is om syngene modellen te genereren, toch?

En omdat ze syngeen zijn, zoals ik eerder zei, kun je echt de hele interactie waarderen tussen een compleet dier, een complete muis, en de tumor die je ontwikkelt, terwijl je volledige controle hebt over de genetica van de tumor. En dus natuurlijk, vergeleken met andere modellen waarbij je misschien probeert het immuunsysteem in de petrischaal te begrijpen, is het natuurlijk heel moeilijk om het immuunsysteem in de petrischaal te repliceren. Of als je PDX's neemt, zoals monsters, tumormonsters van patiënten die je vervolgens in muizen stopt, kunnen de muizen geen immuunsysteem hebben om dat te laten werken, anders wordt deze tumor afgestoten, toch?

Maar omdat dit model syngeen is, kun je echt de hele interactie waarderen van de hele gastheer met de tumor en vooral met het immuunsysteem, wat op dit moment een van de heetste onderzoeksgebieden in het veld is. Dus ik denk echt dat dat het belangrijkste voordeel is van dit protocol vergeleken met andere protocollen die je elders vindt. Dus eigenlijk gebruiken we deze modellen al om enkele zeer interessante fenomenen te onderzoeken.

Ik zou zeggen dat de vraag die mij nu het meest interesseert, is hoe het adaptieve immuunsysteem, voor zover we hebben gezien, een belangrijke bijdrage lijkt te leveren aan het vormen van de genomische eigenschappen, met name kopienummervariaties van hooggradige sereuze eierstokcarcinomen, in de zin dat als het immuunsysteem er niet is, deze tumoren eigenlijk niet zulke enorme en complexe DNA-herschikkingen ontwikkelen. Dus proberen we uit te zoeken hoe dit kan gebeuren en hoe we hopelijk kunnen proberen het om te keren om eventuele immuuntherapieën ertegen te versterken.