Snelle optimalisatie van een licht-induceerbaar systeem om de genexpressie van zoogdieren te beheersen

Dit project heeft als doel een methode met hoge doorvoer te ontwikkelen om een multicomponent-optogenetisch hulpmiddel genaamd LACE te optimaliseren en karakteriseren voor zoogdiergenexpressie. Om te beginnen plaats je een celkweekfles met HEK 293 T-cellen in een bioveiligheidskast. Gebruik een serologische pipet om het gebruikte medium te aspireren.

Pipette 10 milliliter DPBS op één hoek van de fles en draai voorzichtig om de cellen te wassen. Daarna aspireer je de wasoplossing en gooi je zowel de DPBS als de aspirator in de afvalcontainer. Voeg nu 1,5 milliliter 0,05% trypsine-EDTA toe aan de kolf om het oppervlak te bedekken, en incubeer dan.

Tik zachtjes op de kolf om de cellen van het oppervlak los te maken. Pipetteer vervolgens 8,5 milliliter verse DMEM in de kolf. Aspireer de oplossing op en neer totdat er geen aggregaten meer zichtbaar zijn om de cellen opnieuw te laten ophangen.

Vervolgens breng je negen milliliter van de celsuspensie over in een 15-milliliter conische buis. Voeg negen milliliter verse DMEM toe aan de kolf. Incubeer de suspensie tot een samenvloeiing onder 5% kooldioxide bij 37 graden Celsius.

Meng nu 10 microliter van de suspente cellen met 10 microliter trypsine kleurstof in een één-op-één verhouding om de celconcentratie te berekenen met een hemocytometer. Zaad ongeveer 35.000 cellen in 100 microliter in elke put van een high-performance getall-1,5, zwarte, 96-put glazen bodemplaat. Plaats het bord in een broedmachine die is ingesteld op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende 24 uur.

Voor transfectie aliquot eerst 11 microliter warme, serumvrije DMEM in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis voor één put en 10% overschot. Bereid verschillende plasmidmassaverhoudingen van CRY2-versterkt groen fluorescerende eiwit voor tot CIBN-geleidend RNA/Aliquot 110 nanogram per put van de voorbereide oplossingen in elke buis met het serumvrije medium aliquots. Daarna pipetteer je extra 11 microliter serumvrije DMEM per put in aparte buizen voor transfectie-reagentiaverdunning.

Voeg het verdunde transfectie-reagens toe aan het DNA-mediummengsel en incubeer om de transfectiecomplexen te vormen. Vervolgens pipetteer je 20 microliter van het voorbereide transfectiecomplex naar elke put van de 96-put plaat met de HEK 293 T-cellen. Wikkel de 96-well-plaat in aluminiumfolie en plaats deze in een broedmachine die op 37 graden Celsius staat onder 5% kooldioxide gedurende 24 uur.

Om het activatieproces te starten, pas je de microcontroller-invoercode aan om de gewenste putten te verlichten met behulp van de opgegeven scriptlijnen. Stel de lichtgevende diodeintensiteit in op 9,27 milliwatt per vierkante centimeter met behulp van de aangegeven codelijnen. Stel de pulslengte aan op één seconde en stel de pulsfrequentie dan in op 0,067 hertz, gelijk aan elke 15 seconden.

Spuit het 3D-geprinte deksel van de optoPlate met 70% ethanol. Laat het daarna drogen in een bioveiligheidskast. Doe nu een roodlampje aan in de donkere kamer.

Plaats de 96-put plaat in de bioveiligheidskast. Vervang het plaatdeksel door het gedroogde 3D-geprinte deksel. Plaats de 96-well-plaat op de LED-array om het activeringsapparaat in elkaar te zetten.

Plaats het volledig in elkaar gezette LED-array-apparaat in een broedmachine die 24 uur lang op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide staat. Sluit de microcontroller, lichtdiode en ventilatorpoorten aan op een stroombron. Om flowcytometrie uit te voeren, voer je het systeemstartprogramma uit op de site expert software.

Laad twee milliliter gedeïoniseerd water in de monsterlader. Voer kwaliteitscontrole uit met behulp van de meegeleverde kwaliteitskralen. Stel de monsterputten op en specificeer ze voor verwerving.

Maak de grafieken en tabellen voor zijverstrooiing versus voorwaartse verstrooiing, zijverstrooiingshoogte versus zijverspreidingsgebied, zijverstrooiingsgebied versus FITC-A, en de FITC-A statistiektabel. Klik nu de V-bodem 960-put plaat in de plaatlader van de cytometer. Selecteer een niet-getransfecteerde put en klik op Initialiseren, gevolgd door Run.

Pas de zijverstrooiing en FITC-spanningen aan om de populatie van belang te centreren op de SSC-A versus FSC-A grafiek. Klik op Run en selecteer vervolgens een CMV-versterkt groen fluorescerende eiwit dat goed getransfecteerd is. Pas de FITC-spanning aan om zowel autofluorescerende als fluorescerende cellen op te nemen in de SSC-A versus FITC-A grafiek.

Creëer een polygoon om de gezonde celpopulatie te gaten. Een tweede polygoon om te gateen voor dubbelt-discriminatie op de SSC-H versus SSC-A plot. Maak een polygonpoort om fluorescerende cellen te onderscheiden van niet-fluorescerende cellen met behulp van de poort van de niet-getransfecteerde cellen als referentie.

Automatisch opnemen monsters met 60 microliter per minuut totdat er 200 seconden zijn verstreken of 10.000 gebeurtenissen zijn bereikt. Exporteer vervolgens de gemiddelde FITC-waarden als een CSV-bestand en analyseer de data. Maak de flowcytometer schoon door de optie voor dagelijks schoonmaken te kiezen.

Fluorescentiebeeldvorming toonde aan dat bij een massaverhouding van één op negen activatie van blauw licht een lagere maximale eGFP-expressie induceerde vergeleken dan de vijf-op-vijf verhouding, wat ook verhoogde lekkage vertoonde in de donkere conditie. Flowcytometrie toonde aan dat meer dan 95% van de gegated events in P1 singlets waren over alle aandoeningen. En niet-getransfecteerde cellen hadden minder dan 0,1% eGFP-positieve populatie.

De CMV-eGFP-controle had ongeveer 99%eGFP-positieve cellen, terwijl 2pLACE-transfecteerde cellen ongeveer 57% hadden. De CMV-eGFP-getransfecteerde cellen vertoonden sterke constitutieve eGFP-expressie onder zowel lichte als donkere omstandigheden, terwijl niet-getransfecteerde cellen geen zichtbare fluorescentie vertoonden. Het bevestigde ook succesvolle transfectie van 2pLACE en activatie van eGFP-expressie onder blauw licht met een lagere expressie dan CMVeGFP. Een drievoudige toename van eGFP-expressie werd waargenomen in lichtgeactiveerde 2pLACE-monsters vergeleken met donkere omstandigheden.

Het percentage eGFP-positieve cellen in 2pLACE-transfecteerde monsters was ongeveer 60%. De massaverhouding van drie op zeven leverde de hoogste gemiddelde fluorescentieintensiteit en dynamisch bereik op. Dit protocol maakt de high-throughput evaluatie van monsters en technische replicatie mogelijk met behulp van de optoPlate om verschillende lichtcondities en pulsfrequenties te programmeren.