Stimulatie van vasculaire endotheelcellen met behulp van neutrofiele extracellulaire vallen in aanwezigheid van lipoproteïne met lage dichtheid

Neutrofiele extracellulaire vallen zijn betrokken bij een verscheidenheid aan ziekten, waaronder hart- en vaatziekten. De synergetische effecten van NET-vorming en lipoproteïnen op vasculaire cellen blijven echter onduidelijk. Gebruikmakend van dit protocol is tot op heden een mechanistische analyse aan de gang van hoe ontstekingsreacties worden geïnduceerd in menselijke aorta-endotheelcellen die worden behandeld met neutrofiele extracellulaire vallen en lipoproteïne met lage dichtheid.

We hebben aangetoond dat lipoproteïne met hoge dichtheid werkt als een onderdrukker van NET-vorming. Dat wordt bevorderd door geoxideerd lipoproteïne met lage dichtheid, geoxideerde fosfolipiden en lysofosfolipiden. Centrifugeer om te beginnen 45 tot 50 milliliter menselijk volbloed verkregen in een heparinebuis bij 700 G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius.

Verlaag langzaam de centrifugesnelheid na het centrifugeren en verzamel vervolgens de bovenste laag met de plasmafractie. Centrifugeer de plasmafractie twee keer bij 700 G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius om de bloedcellen volledig te verwijderen, met behoud van dezelfde vertragingsinstelling. Voeg vervolgens een microliter 250 millimolaire EDTA-oplossing per één milliliter plasma toe om tweewaardige metaalion-gemedieerde oxidatie van lipoproteïnen te voorkomen.

Plaats 2,7 milliliter van het plasma in de ultracentrifugebuis. Overlay met 900 microliter PBS met 250 micromolaire EDTA. Ultracentrifugeer vervolgens de buis bij 600.000 G gedurende zeven minuten bij vier graden Celsius.

Gooi vervolgens 900 microliter van de bovenste laag weg om de chylomicronfractie te elimineren. Voeg 900 microliter PBS met EDTA toe aan het resterende plasma en ultracentrifugeer bij 600.000 G gedurende 2,5 uur bij vier graden Celsius. Gooi 900 microliter van de toplaag weg om de lipoproteïnefractie met zeer lage dichtheid te elimineren.

Voeg vervolgens 540 microliter kaliumbromideoplossing van 0,5 gram per milliliter toe aan het plasma om de dichtheid aan te passen tot 1,063. Meng de inhoud voorzichtig met een pipet en ultracentrifuge bij 600.000 G gedurende 2,5 uur bij vier graden Celsius. Verzamel 540 microliter van de toplaag met lipoproteïne met lage dichtheid.

Breng de verzamelde fractie over in een dialysemembraan en dialyseer tegen twee liter PBS met EDTA bij vier graden Celsius in het donker om kaliumbromide te elimineren. Voeg 152 microliter 0,01% polylysine of 0,1% gelatineoplossing toe aan elk putje van een plaat met 12 putjes en incubeer gedurende ten minste vijf minuten bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens de oplossing uit de putjes, was een keer met 200 microliter steriel water en laat de putjes volledig drogen bij kamertemperatuur.

Bewaar de voorbereide plaat bij kamertemperatuur tot verder gebruik. Bereid de met gelatine beklede platen voor volgens dezelfde procedure als aangegeven voor polylysine. Kweek twee keer tien tot de macht zes HL60 cellen per 10 milliliter in RPMI-1640 medium, aangevuld met twee micromolaire all-trans retinoïnezuur.

Verzamel na vier dagen incubatie met all-trans retinoïnezuur de HL60-cellen. Centrifugeer de verzamelde cellen bij 220 G gedurende vier minuten bij 18 tot 22 graden Celsius. Zuig het supernatant op en was de cellen vervolgens met een gelijk volume serumvrij RPMI-1640-medium.

Centrifugeer de gewassen cellen opnieuw bij 220 G gedurende vier minuten bij 18-22 graden Celsius en suspendeer de cellen in serumvrij RPMI-1640-medium. Nadat u de celconcentratie hebt aangepast van twee keer tien tot de macht van zes cellen per milliliter, zaait u 0,5 milliliter van de suspensie in elk putje van een plaat met 12 putjes die is voorgecoat met polylysine. Voeg 100 microliter serumvrij RPMI-1640 medium toe met of zonder 300 nanomolaire phorbol 12-myristaat, 13-acetaat of PMA.

Kweek de cellen gedurende 30 minuten. Verwijder vervolgens het medium uit de putjes. Was de cellen één keer met serumvrij RPMI-1640-medium en vervang het door serumvrij RPMI-1640 met nul of 20 microgram per milliliter lipoproteïne met lage dichtheid.

Ga twee uur door met het kweken van de cellen. Verzamel het kweekmedium van elk putje in een buis en centrifugeer gedurende drie minuten bij 700 G bij 18 tot 22 graden Celsius om celresten te verwijderen. Verkrijg voor stimulatie de menselijke aorta-endotheelcelcultuur en vervang het gebruikte medium door 0,5 milliliter vers kweekmedium en incubeer de cellen gedurende 30 minuten.

Voeg ten slotte 167 microliter van het kweekmedium dat is verzameld uit neutrofielenachtige cellen die neutrofiele extracellulaire vallen en LDL bevatten, toe aan menselijke aorta-endotheelcelschalen. Stimulatie van menselijke aorta-endotheelcellen met neutrofiele extracellulaire vallen leidde tot dosisafhankelijke morfologische veranderingen van een geplaveide naar een langwerpige vorm. Morfologische veranderingen in menselijke aorta-endotheelcellen werden versterkt wanneer ze werden gestimuleerd met LDL-geïnduceerde extracellulaire neutrofielenvallen, met zichtbare verlenging die al na zes uur zichtbaar was.