In het veld inzetbaar lensloos beeldvormingsplatform voor snelle labelvrije analyse van de activering van natural killer-cellen
8 augustus 2025
Dit protocol beschrijft een labelvrije methode voor de snelle analyse van het aantal en de activiteit van natural killer (NK) cellen met behulp van lensloze schaduwbeeldvormingstechnologie. Deze methode kwantificeert morfologische veranderingen in individuele NK-cellen door computeranalyse van hun diffractiepatronen.
Ons doel is om de immuunfunctie snel te beoordelen door de activering van NK-cellen in realtime te kwantificeren, met behulp van labelloze, lensvrije beeldvorming om de immuunmonitoring te verbeteren. We hebben aangetoond dat de aangeboren immuniteitsindex, of I3, op betrouwbare wijze onderscheid maakt tussen de NK-celactiviteit van gezonde en immuungecompromitteerde donoren en sterk correleert met de cytokines en flowcytometriemarkers. De bestaande NK-celtesten vereisen labels, omvangrijke instrumenten en lange incubatietijden.
Ons LSIT-platform vult deze leemte op door snelle, betaalbare en labelvrije profilering mogelijk te maken met behulp van eenvoudige opto-elektronica. Ons labelvrije LSIT-platform differentieert NK-celactivering op een enkel celniveau binnen 30 seconden met behulp van schaduwparameters, waardoor kleuring en dure flowcytometrie niet meer nodig zijn. We zullen LSIT uitbreiden om de activering van T- en B-cellen te monitoren en deep learning-algoritmen te integreren voor high-throughput classificatie van verschillende immuunceltoestanden.
Haal om te beginnen de kits voor natural killer, of NK, celisolatie uit de koelkast en laat ze op kamertemperatuur komen, tussen 15 en 28 graden Celsius. Bereid de benodigde apparatuur voor door het plaatsen van een magnetische scheider, pipetten met steriele punten en stel een broedmachine of verwarmingsblok in op 37 graden Celsius. Voeg met een pipet 0,5 milliliter volbloed toe aan de reactiebuis met groene dop die de antilichaamcocktail bevat.
Meng de inhoud voorzichtig door vijf tot zes keer op en neer te pipetteren in de buis. Incubeer de buis vervolgens gedurende vijf minuten. Breng de volledige inhoud van de buis met groene dop over in de buis met rode dop met behulp van een pipet en meng voorzichtig door de buis vijf tot zes keer te pipetteren.
Plaats de buis met rode dop op de magnetische scheider en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Terwijl u de magneet op zijn plaats houdt, gebruikt u een pipet om ongeveer 1.5 milliliter van het bovenstaande over te brengen in de scheidingsbuis met paarse dop twee. Meng de inhoud voorzichtig door de slang vijf tot zes keer te pipetteren.
Plaats nu de buis met paarse dop op de magnetische scheider en incubeer gedurende 10 minuten. Terwijl de magneet nog op zijn plaats zit, brengt u met behulp van een pipet ongeveer 1 milliliter van het bovenstaande over in een herstelbuisje met een grijs deksel en mengt u de inhoud voorzichtig door het buisje te pipetteren. Voeg vervolgens 100 microliter van de geïsoleerde natural killer-celsuspensie toe aan de voertuigbuis en nog eens 100 microliter aan de activeringsstimulatorcocktail, of ASC-buis.
Meng de inhoud van beide buizen voorzichtig met behulp van een vortexmixer om een gelijkmatige verdeling te garanderen. Incubeer de buizen in het verwarmingsblok of de broedmachine gedurende een uur op 37 graden Celsius. Schakel het LSIT-platform in.
Start de LSIT-opnamesoftware. Log in door uw ID en wachtwoord in te voeren en selecteer vervolgens Kalibreren om de kalibratiemodus te starten. Druk op de Open-knop op het touchscreen of gebruik de fysieke schuifdeurknop om de lade te openen.
Wanneer de lade opengaat, verwijdert u de kalibratieschuif en bergt u deze op. Klik nu op Achtergrond instellen om de optische intensiteit te kalibreren. Plaats de kalibratieschuif terug in de lade en sluit de lade.
Klik vervolgens op Kalibratie starten om het proces te voltooien. Haal een analyseglaasje uit het zakje. Label het met de voorbeeldgegevens voordat u het op een schone, vlakke ondergrond plaatst.
Pipetteer 10 microliter van het voertuigmonster in de kanalen A en B en pipetteer vervolgens 10 microliter van het ASC-gestimuleerde monster in de kanalen C en D. Druk nu op Open om de lade uit te werpen. Verwijder de kalibratieschuif en plaats deze in een opbergdoos. Plaats de voorbereide analyseschuif in de lade en druk op Sluiten om deze vast te zetten.
Ga terug naar het hoofdmenu en selecteer de NK-celactiviteit en -test in het hoofdscherm. Voer de voorbeeld-ID in of scan de streepjescode om het voorbeeldprofiel te laden. Druk vervolgens op Vastleggen om de beeldopname te starten.
Klik na het vastleggen van de afbeelding op Analyseren om de verwerking te starten. Bekijk het NK-celactiviteitspercentage en het aantal cellen dat op het scherm wordt weergegeven. Download de resultaten naar een USB-station of druk ze af met behulp van het touchscreen-menu.
Selecteer Cellen tellen en testen op de LSIT-hoofdinterface. Laad met behulp van een pipet 10 microliter van het nieuwe monster op een vers analysediakanaal. Plaats de schuif in de lade.
Sluit de lade met behulp van het touchscreen of de knop en voer de voorbeeld-ID in op het systeem. Voer de verdunningsfactor in op het touchscreen, indien van toepassing, en druk op Tellen om de celkwantificering te starten. Bekijk de resultaten die als cellen per microliter op het scherm worden weergegeven.
Open na analyse de lade door op de knop Openen te drukken of de fysieke schakelaar om te zetten. Verwijder de gebruikte schuif uit de lade met gehandschoende handen. Plaats ten slotte de kalibratieschuif terug in de lade om de sensor te beschermen en sluit de lade met behulp van het touchscreen of de fysieke tuimelschakelaar.
Het LSIT-platform met geïntegreerde software beoordeelde de activering van NK-cellen kwantitatief door de CSP-waarden van geactiveerde en niet-gestimuleerde controlecellen te vergelijken. Het voorzag het immuniteitsrapport van een samengevatte statistische tabel. ASC-stimulatie induceerde duidelijke morfologische veranderingen in NK-cellen, waaronder een grotere omvang en cytoplasmatische complexiteit, zoals gezien in Hema 3-gekleurde cytospins na 30 minuten en twee uur.
Schaduwbeelden toonden aan dat ASC-gestimuleerde cellen zichtbaar complexere diffractiepatronen hadden in vergelijking met voertuigcontroles, waarbij geëxtraheerde parameters een grotere piek-tot-piekafstand, cytoplasmatische granulariteit en gecombineerde schaduwparameter aangaven. Gecombineerde schaduwparameterwaarden maakten een duidelijke classificatie mogelijk tussen gezonde donoren en kankerpatiënten, met minimale overlap in individuele celverdelingen van geactiveerde en niet-geactiveerde NK-cellen. Gezonde donoren vertoonden significant hogere aangeboren immuniteitsindexwaarden dan kankerpatiënten na ASC-stimulatie.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een labelvrije methode voor de snelle analyse van het aantal en de activiteit van natural killer (NK)-cellen op enkelcelniveau met behulp van lensvrije schaduwbeeldvormingstechnologie. Deze methode kwantificeert morfologische veranderingen in individuele NK-cellen door middel van gecomputeriseerde analyse van hun diffractiepatronen.
Belangrijkste Componenten van de Studie
Wetenschappelijk gebied
- Immunologie
- Celbiologie
- Beeldvormingstechnologie
Achtergrond
- Huidige assays voor NK-cellen vereisen labels en tijdrovende processen.
- Bestaande methoden maken vaak gebruik van omvangrijke instrumenten en lange incubatietijden.
- Er is behoefte aan snelle en betaalbare technieken voor immuunmonitoring.
- Lensvrije beeldvorming kan de beoordeling van de immuunfunctie verbeteren.
Doel van de studie
- Om de immuunfunctie snel te beoordelen door NK-celactivatie in real time te kwantificeren.
- Om een labelvrije methode te bieden voor het profileren van NK-cellen.
- Om onderscheid te maken tussen NK-celactiviteit van gezonde en immuungecompromitteerde donoren.
Gebruikte methoden
- Lensvrije schaduwbeeldtechnologie (LSIT).
- Gecomputeriseerde analyse van diffractiepatronen.
- Realtime monitoring van NK-celactivatie.
- Integratie van deep learning-algoritmen voor classificatie van immuunceltoestanden.
Belangrijkste resultaten
- LSIT onderscheidt NK-celactivatie op single-celniveau binnen 30 seconden.
- De index voor aangeboren immuniteit (I3) correleert met cytokinen en markers uit flowcytometrie.
- Het elimineren van kleuring en kostbare flowcytometrie verhoogt de efficiëntie.
- Potentieel om LSIT uit te breiden voor het monitoren van T- en B-celactivatie.
Conclusies
- Het LSIT-platform biedt een snelle, betaalbare en labelvrije profileringsmethode.
- Deze methode verbetert de mogelijkheden voor immuunmonitoring.
- Toekomstige toepassingen kunnen onder meer de high-throughput classificatie van verschillende immuunceltoestanden omvatten.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Snelle, labelvrije kwantificering van NK-celactivatie met behulp van lensvrije schaduwbeeldtechnologie (LSIT) pakt een kritieke bottleneck aan bij de beoordeling van de immuunfunctie voor translationeel en preklinisch onderzoek. Door real-time, kwantitatieve immuunprofilering mogelijk te maken zonder dat kleuring of flowcytometrie vereist is, verbetert dit platform het voorspellende vertrouwen en de operationele efficiëntie op cruciale beslismomenten tijdens ontdekking en validatie. De aanpak ondersteunt schaalbare immuunmonitoring, wat risico-gecorrigeerde portfoliobeslissingen in immunologie-gedreven R&D faciliteert.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt kwantitatieve analyse van NK-celactivatie mogelijk als functionele immuunread-out.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door het onderscheid te maken tussen responsen van gezonde versus immuungecompromitteerde donoren.
- Levert snelle, labelvrije data ter ondersteuning van targetvalidatie en mechanistische studies.
- Faciliteert voorspellend vertrouwen in de activering van immuunpaden.
Screening & Assayontwikkeling
- Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare metrieken voor single-cell activatie die geschikt zijn voor assay-ontwikkeling.
- Verkort de doorlooptijd van de assay door kleuring en complexe instrumentatie te elimineren.
- Maakt high-throughput profilering van immuuncellen mogelijk voor compound-screening workflows.
- Ondersteunt de schaalbaarheid van het platform en hergebruik over verschillende immuunceltypen heen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt immuunactivatiemetrieken uit met functionele eindpunten die relevant zijn voor de ziekte.
- Biedt continuïteit van de ontdekkingsfase tot aan preklinische immuunmonitoring.
- Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling mogelijk op basis van kwantitatieve immuunfunctie.
- Ondersteunt de ontwikkeling van translationele biomarkers voor aangeboren immuniteit.
Integratie van Pipeline & Workflow
Het LSIT-platform integreert in het continuüm van ontdekking naar preklinische fase door snelle, kwantitatieve gegevens over de activering van immuuncellen te verschaffen, wat zowel bijdraagt aan vroege targetvalidatie als aan daaropvolgend translationeel onderzoek.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking via real-time meting van NK-celactivatie.
- Screening: Biedt reproduceerbare, kwantitatieve resultaten voor de gereedheid van assays op basis van immuuncellen.
- Analytics: Levert statistische output zoals de innate immunity index (I3) en combined shadow parameter (CSP) voor een robuuste vergelijking van condities.
- Translational Research: Slaat een brug tussen discovery en preklinische validatie met ziekterelevante immuunprofilering.
- Enterprise Reuse: Biedt een schaalbaar, labelvrij platform dat aanpasbaar is voor aanvullende immuunceltypen en functionele assays.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de beoordeling van de immuunfunctie.
- Operationele waarde: Stroomlijnt workflows door standaardisatie, een snelle doorlooptijd en minimale monstervoorbereiding.
- Strategische waarde: Maakt snellere go/no-go-beslissingen mogelijk en verbetert de kapitaalefficiëntie door de afhankelijkheid van arbeidsintensieve assays te verminderen.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en de verdere ontwikkeling van activa die gericht zijn op immunologie.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in immuuncelisolatie en kwantitatieve beeldanalyse.
- Afhankelijk van toegang tot LSIT-instrumentatie en geïntegreerde analysesoftware.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor monsterverwerking en datainterpretatie.
- Aanpasbaar aan diverse immuunceltypen door optimalisatie van het protocol.
- Beperkt door de noodzaak van propriëtaire activatoren en platformspecifieke reagentia.
