Kwantificering van de opname van endotheliale vetzuren met behulp van fluorescerende vetzuuranalogen

Bloedgedragen voedingsstoffen, net als vetzuren, moeten een capillaire endotheelbarrière passeren om via slecht begrepen mechanismen het metabole weefsel binnen te dringen. Het verduidelijken van deze processen zou nieuwe therapeutische doelen kunnen onthullen voor de behandeling van metabole ziekten, zoals type 2 diabetes. We ontdekten dus dat scalpelspier en vetweefsel beide de opname en transport van endotheliale lipiden reguleren met behulp van paracriene metabolieten, deels ook gecontroleerd door het endocriene systeem.

En we hebben ook ontdekt dat mitochondriale ATP onverwacht bijdraagt aan de opname van endotheliale vetten, ondanks hun bekende afhankelijkheid van glycolytisch ATP. Met behulp van de assay die in dit protocol is beschreven, zijn we van plan dieper te onderzoeken in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de opname en het transport van endotheelvetzuren, inclusief hoe dit mogelijk wordt gereguleerd door ander weefsel. Om te beginnen bereid je een 0,1% gelatineoplossing door 25 milliliter 2% gelatinevoorraad toe te voegen aan 475 milliliter PBS.

Meng de gelatineoplossing grondig en steriliseer deze met een 0,2 micrometer vacuümfilter of autoclave. Voeg met een pipet 100 microliter van de 0,1% gelatineoplossing toe aan elke put van een zwarte, heldere onderste plaat met 96 putjes. Plaats het bord minstens 30 minuten of een nacht in een broedmachine bij 37 graden Celsius.

Na de incubatie verwijder je extra gelatineoplossing van de voorgecoate 96-put plaat. Was het bord één keer met PBS. Vervolgens pipetteer je 100 microliter van de cel in elke put met een zaaidichtheid die het mogelijk maakt dat de cellen de volgende dag samenkomen.

Bereid 20 millimolaire oplossingen van 3-hydroxyisobutyraat en lactaat voor als positieve controles. Voor de negatieve controle gebruik je één micromolaire niclosamide. Vervolgens pipette je de oplossingen in een aparte 96-well plaat.

Was de endotheelcellen één keer met voorverwarmde divalente PBS, en pipetteer onder een steile hoek om te voorkomen dat de geplateerde cellen worden verstoord. Voeg 50 microliter per put van het juiste behandelreagens toe en incubeer de plaat bij 37 graden Celsius gedurende 30 tot 60 minuten. Om het BODIPY-vetzuur-BSA-complex te bereiden, meng je een 2-micromolaire BODIPY-vetzuuroplossing met 1 micromolair vetzuurvrij BSA in PBS.

Incubeer het mengsel 10 minuten in het donker op kamertemperatuur voordat je het gebruikt. Voeg vervolgens 50 microliter van het voorbereide BODIPY-vetzuurcomplex BSA-complex toe aan elk goed behandeld complex en incubeer de plaat vijf minuten op 37 graden Celsius. Bereid een 1 micromolaire oplossing van vetzuurvrije BSA voor in PBS als wasfilter en verwarm deze voor tot 37 graden Celsius.

Verwijder het BODIPY-vetzuur BSA-complex uit de putjes en was het hele bord twee keer met 50 microliter voorverwarmde wasbuffer, waarbij elke wasbeurt 1,5 minuut duurt. Voeg vervolgens 50 microliter 0,08% trypanblauw toe aan elke put om extracellulaire fluorescentie te dempen. Meet onmiddellijk intracellulaire fluorescentie met een microplaatlezer.

Na het verwijderen van de trypanblauwe oplossing uit de holtes, was je de cellen voorzichtig met PBS. Voeg 4 microgram per milliliter Hoechst-kleurstof verdund in 10% medium toe aan elke put. Breng de plaat 30 minuten uit bij 37 graden Celsius.

Was het bord daarna één keer met PBS om overtollige verf te verwijderen. Voeg daarna verse PBS toe aan elke put en meet de Hoechst-fluorescentie met een microplaatlezer. In zowel HUVEC- als EA.hy926-cellen nam het intracellulaire BODIPY-C12-signaal significant toe bij hogere concentraties van BODIPY-vetzuren na één minuut, vijf minuten en tien minuten incubatie.

Lactaatbehandeling van één uur verhoogde de opname van BODIPY-C12 op een dosisafhankelijke manier bij concentraties 5 millimolaire en 20 millimolaire. Behandeling met 3-hydroxyisobutyraat verbeterde ook significant de opname van BODIPY-C12 op dosisafhankelijke wijze, met de hoogste opname van 20 millimolair. Behandeling met 1 micromolair niclosamide gedurende 30 minuten leidde tot een significante vermindering van de opname van BODIPY-C12 vergeleken met onbehandelde DMSO-controle.

Na vijf minuten incubatie met BODIPY-C16 in HUVEC verhoogde lactaatbehandeling met 10 millimolair en 20 millimolair de opname significant op dosisafhankelijke wijze. Behandeling met 1 micromolair niclosamide verminderde significant de opname van BODIPY-C16 vergeleken met de onbehandelde DMSO-controle.