Evaluatie van het effect van SASP-factoren op de proliferatie van kankercellen met behulp van een vergelijkende analyse van drie verschillende methodologieën

Verouderde kankercellen scheiden dergelijke factoren af die naburige cellen beïnvloeden. We presenteren drie in vitro modellen om SASP-gedreven paracriene en juxtacrine effecten op HeLa-celproliferatie te bestuderen, realtime impedantiemonitoring en levende-cel beeldvorming die dynamische, kinetische en morfologische analyses aantonen die senescente en micro-omgevingsparacriene effecten onthullen buiten traditionele eindpuntassays. Om te beginnen, zet het realtime celanalysesysteem aan voordat je begint met celzaaien.

Start RTCA software versie 2.0. Klik op de X-notitieknop en voer de experimentele details in. Klik op de knop Inplannen en voeg twee stappen toe om elke 15 minuten gedurende 72 uur de achtergrond op te nemen en de celproliferatie te monitoren.

Kies de eerste stap en klik op Spelen. Voeg handmatig 50 microliter volledig medium toe aan elke put van het e-plaatbeeld. Vervolgens was je zowel de senescente als niet-senescent HeLa-cellen met vijf milliliter steriele, voorverwarmde PBS.

Voeg na het aspireren één milliliter voorverwarmde 0,05% trypsine toe en laat je incuberen. Neutraliseer de trypsine met vijf milliliter antibioticum-aangevuld volledig DMEM. Centrifugeer vervolgens de cellen op 500 G bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.

Na het afwerpen van het supernatant worden de celpellets opnieuw opgehangen in vijf milliliter antibiotica-aangevuld complete DMEM. Plaats nu niet-senescente HeLa-cellen in elke put van één e-plaatbeeld in 100 microliter antibiotica-aangevuld volledige DMEM. Plaats het e-plaatbeeld in de houder van het real-time celanalysesysteem zodat de cellen zich kunnen hechten aan het plaatoppervlak in de incubator.

Kies de tweede stap en klik op Afspelen om impedantiemeting te starten. Zaadcellen in de e-plate insertputten met 60 microliter antibiotica-aangevuld maken DMEM compleet onder drie verschillende experimentele opstellingen. Houd de e-plate inzet zes uur lang op 37 graden Celsius in een broedmachine met 5% kooldioxide voor de bevestiging.

Klik op Pauzeren na zes uur celzaaien, en aspireer vervolgens voorzichtig het kweekmedium uit elke put van het e-plaatzicht om serum en niet-hechtende cellen te verwijderen. Was putten twee keer met voorverwarmde PBS bij 37 graden Celsius. Voeg 140 microliter serumvrije DMEM toe aan elke put van het e-plaatbeeld.

Verwijder het medium. Was putten van e-plate insert met PBS, voeg daarna 60 microliter serumvrije DMEM toe. Plaats nu de e-plaat-insert in het e-plaatbeeld.

Druk zachtjes totdat het inzetstuk volledig in de put zit. Plaats de gecombineerde plaat in het realtime celanalysesysteem. Klik op Afspelen om de realtime monitoring van celindexwaarden met 15 minuten te hervatten met de software.

Normaliseer de celindexwaarden op het moment dat de e-plaatweergave en e-plaat-insert worden gecombineerd en in het realtime celanalysesysteem worden ingevoegd. Vervolgens drukt u op de knop Data Analysis om de proliferatiesnelheid en -hoeveelheid te berekenen met behulp van de maximale celindex en hellingsgegevens verkregen uit het real-time celanalysesysteem. Analyseer vervolgens de data met een geschikt statistisch programma.

Aspireer het kweekmedium van beide zes-wellplaten die de senescente en niet-senescente HeLa-cellen bevatten. Was de cellen twee keer met voorverwarmde PBS bij 37 graden Celsius om restanten van serum en celresten te verwijderen. Voeg twee milliliter serumvrij, met antibiotica aangevuld DMEM-medium toe aan elke put en incubeer vervolgens de cellen in een bevochtigde broedmachine bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide gedurende 48 uur.

Verzamel het geconditioneerde medium uit elke put in steriele buizen in een laminaire veiligheidskast. Centrifugeer het verzamelde geconditioneerde medium bij 1000 g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius om celresten te verwijderen, gevolgd door centrifugatie bij 10.000 g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius om het geklaarde supernatant te verkrijgen. Centrifugeer vervolgens het geconditioneerde medium met twee-milliliter ultracentrifugale filterunits op vier graden Celsius gedurende 60 minuten en 3000 g om het te concentreren tot 400 microliter.

Verdun het verkregen concentraat met vers serumvrij medium om 1x, 2x en 3x geconcentreerd geconditioneerd medium in steriele buizen in een laminaire veiligheidscabine te bereiden. Wanneer de cellen zich hebben gehecht, aspireer je voorzichtig het kweekmedium uit elke put van het e-plaatzicht om serum en niet-hechtende cellen te verwijderen en was je het met PBS. Vervolgens pipeteerde ik 200 microliter vooraf verzamelde geconditioneerde media bij 37 graden Celsius in elke groep.

Voeg de e-plaatweergave in in het real-time celanalysesysteem en klik op Afspelen om de realtime monitoring van celindexwaarden te hervatten met intervallen van 15 minuten gedurende 48 uur. Zaadcellen op een micro-dia-laag onder drie experimentele opstellingen en incuberen bij 37 graden Celsius in een bevochtigde atmosfeer met 5% kooldioxide. Na acht uur hechting was je de cellen twee keer met voorverwarmde PBS op 37 graden Celsius.

Voeg 200 microliter serumvrije Dulbecco's Modified Eagle's Medium toe aan elke put. Zet de temperatuurregelaar 2002-2 aan en zet hem op 37 graden Celsius. Zet de CO2-Controller 2000 aan en zet hem op 5% kooldioxide.

Zet de fluorescentielichtbron aan. Plaats de glijbaan op de incubatiekamer bovenaan het podium. Start de software op de computer.

Selecteer het 20x-doel. Voeg het fasecontrastkanaal en het fluorescentiekanaal van FITC toe. Met de stagecontroller markeer je de posities voor elke locatie.

Stel het tijdsinterval in op 30 minuten en de opnameduur op 48 uur, en start dan met de acquisitie. Tel groene fluorescerende eiwitpositieve cellen op beide momenten en bereken de procentuele toename voor analyse. De behandeling met Doxorubicine induceerde aanzienlijk cellulaire senescentie in HeLa-cellen.

Kwantificering van SA-beta-gal-positieve cellen toonde een significant hoger percentage in de met doxorubicine behandelde groep vergeleken met de controle. In de eerste benadering vertoonden niet-senescente HeLa-cellen die co-kweken met senescente HeLa-cellen een significant verhoogde proliferatiesnelheid en capaciteit vergeleken met cellen co-gekweekt met niet-senescente HeLa-cellen. Geconditioneerde media afkomstig van senescente HeLa-cellen bij 2x en 3x concentraties verhoogden significant de proliferatiesnelheid en capaciteit van niet-senescent HeLa-cellen vergeleken met geconditioneerde media van niet-senescente cellen.

In de derde benadering vertoonden GFP-positieve HeLa-cellen na 48 uur co-kweek een significant grotere toename van proliferatie wanneer ze co-kweken met senescente HeLa-cellen werden gekweekt in vergelijking met niet-senescente co-kweek of GFP-only controles.