Dissectie van Zebravis craniofaciale weefsels bij kleuring met Alcian Blue

We onderzoeken de mechanismen waarmee het gehemelte van zebravissen in de loop van de tijd groeit met behulp van vaste monsters en time-lapse-beeldvorming van embryo's met een hoge ruimtelijke temporele resolutie met behulp van light sheet-microscopie. Ons protocol is eenvoudig en gemakkelijk te volgen. Het bevat gedetailleerde stappen voor het ontleden en scheiden van craniofaciale kraakbeenderen van een vijf dagen oude zebravislarve.

Dit protocol heeft een zorgvuldige karakterisering van de vorm van het gehemelte op weefsel- en cellulaire schaal mogelijk gemaakt, waardoor we uiteindelijk het effect van commentaarantigenen op de morfogenese van het gehemelte kunnen beoordelen. Zorg om te beginnen voor 20 tot 25 verdoofde zebravislarven en verwijder de verdoving zodra de larven niet meer bewegen. Voeg 1,5 milliliter 4% paraform aldehyde toe aan de buis en plaats het monster gedurende twee uur op een tuimelschakelaar die is ingesteld op 60 omwentelingen per minuut bij kamertemperatuur.

Verwijder met een pipet zoveel mogelijk van het fixeermiddel uit het buisje. Voeg vervolgens 1,5 milliliter 50% ethanol toe aan het monster en plaats het gedurende 10 minuten op een tuimelschakelaar op kamertemperatuur ingesteld op 60 omwentelingen per minuut. Zuig nu met behulp van een pipet de ethanol uit de buis op en voeg 1,5 milliliter alcian blue stain solution toe aan het monster.

Incubeer de larven 18 tot 20 uur in de vlekoplossing bij kamertemperatuur terwijl ze schommelen met 60 omwentelingen per minuut. Verwijder vervolgens de vlekoplossing met een pipet en was de larven één tot twee minuten op kamertemperatuur met 1,5 milliliter gedestilleerd water op een wip. Voeg vervolgens een milliliter bleekoplossing toe aan het monster en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur zonder de buizen af te dekken.

Verwijder met een pipet de bleekoplossing uit het monster en behandel het monster met weefselklaringsoplossingen één en twee. Voeg na het verwijderen van oplossing twee 1,5 tot twee milliliter bewaaroplossing toe aan het monster. Vanwege het glycerolgehalte moet u zien hoe de bevlekte monsters binnen 10 minuten geleidelijk naar de bodem zinken.

Plaats een bevlekte larve aan de zijkant in de met agarose beklede petrischaal. Schraap met een tang voorzichtig de dooier van het lichaam van de larven. Breng de larven na het verwijderen van de dooier over naar een vers petrischaaltje om interferentie tijdens dissectie te voorkomen, houd de larven in de buurt van de achterkant van het hoofd met behulp van een tang.

Verwijder met een ander paar voorzichtig de ogen zonder de omliggende schedelstructuren van het gezicht te beschadigen. Terwijl u de larve vasthoudt, nog steeds met één tang, maakt u een incisie in het midden van het weefsel dorsaal tot aan de neuroschedel. Knijp vervolgens in de hersenen en de bijbehorende weefsels en trek ze eraf.

Scheid vervolgens de kop van de larven van de rest van het lichaam. Het resulterende hoofdgebied moet de neuroschedel omvatten en de viscerale schedel die nog steeds aan de voorste en achterste uiteinden vastzit. Snijd de twee verbindingspunten tussen de neuroschedel en de viscerale schedel voorzichtig door met een tang om ze volledig te scheiden.

Plaats ten slotte een of twee druppels 100% glycerol op een schoon glasplaatje en breng de ontlede neuroschedel of viscerale schedel over naar het glaasje. Plaats met een tang voorzichtig een dekglaasje op de tissues om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen opgesloten zitten, en sluit het dekglaasje af met nagellak voordat u het beeldvorming maakt. De ontlede neuroschedel vertoonde meerdere duidelijk gelabelde structuren, waaronder de ethmoïde plaat, trabecula en pericardiaal kraakbeen, waardoor gedetailleerde structurele analyse mogelijk was.

De viscerale schedel omvatte het kraakbeen van Meckel en aanvullende elementen zoals het palato-quadraat en het basilbranchiale kraakbeen. Alcian blauwe kleuring vijf dagen na de bevruchting maakte een duidelijke visualisatie van de ethmoïde plaat mogelijk. De breedte en lengte van de ethmoïde plaat waren consistent meetbaar met behulp van beeldanalyse, en de lengte was significant groter dan de breedte, en gekwantificeerde gegevens van 15 monsters.

Het gebied van de ethmoïde plaat werd geëxtraheerd uit beeldgegevens en bevestigd door kwantificering met duidelijke grensmarkeringen. Duidelijke cellulaire rangschikkingen werden waargenomen in de ethmoïde plaat met kubusvormige cellen in het mediale gebied en columercellen in de laterale delen. Dappy kleuring maakte visualisatie van individuele celkernen in de ethmoïde plaat mogelijk.