Lipoproteïne-specifieke fosfolipide-effluxtest met hoge dichtheid

We ontwikkelden een surrogaattest om HDL-gemedieerde verwijdering van coronaire plaquelipiden te meten om het risico op coronaire hartziekte te beoordelen. De huidige uitdaging is het ontwikkelen van een eenvoudige, snelle en robuuste HDL-lipideninstroomassay voor zowel onderzoek als klinische toepassingen. Begin met het toevoegen van alle benodigde inhoud aan een glas onder een chemische dampkap en vortex je het lipidenmengsel kort om de oplossingen te mengen.

Droog het mengsel in een glazen buis onder een zachte stroom stikstof gedurende een uur om een droge lipidefilm aan de onderkant van de buis te vormen. Voor het coaten van calciumsilicaathydraat, plaats je een weegconus van papier in de glazen buis met de gedroogde lipiden en voeg je 80 milligram calciumsilicaathydraatpoeder toe aan de buis waarbij je de kegel gebruikt om het poeder naar de basis te leiden. Voeg onmiddellijk 2 milliliter zoutoplossing toe aan de buis en bedek de bovenkant met Parafilm.

Draai de glazen buis met de hand in vortex om het grootste deel van het lipide van de bodem los te maken. Plaats de glazen buis in een gat in een piepschuimplatform dat aan een vortex is bevestigd en bevestig de buis aan het vortexplatform met versterkte tape. Vortex de glazen buis gedurende 10 minuten en bevestig dat er geen lipide meer op de wand van de buis zit.

Breng de inhoud van de glazen buis over naar een 15-milliliter conische plastic buis met een pipet van 1 milliliter. Was de glazen buis met 3 milliliter zoutoplossing en doe de wash over in dezelfde 15-milliliter buis. Plaats vervolgens de 15-milliliter plastic buis met lipidengecoate calciumsilicaathydraat in een centrifuge en draai op 935G gedurende 2 minuten bij 4 graden Celsius.

Gebruik een lange en fijne pipettip om het supernatant te aspireren. Vanaf de bovenkant van het supernatant laat je de pipettip langzaam langs de zijkant van de buis glijden terwijl je aspireert. Kantel de buis iets tijdens het aspireren en laat ongeveer 200 microliter zoutoplossing boven de pellet om verstoring te voorkomen.

Voeg vervolgens zoutoplossing toe om het totale volume op 5 milliliter te brengen. Herhaal de centrifugatie en het verwijderen van supernatant vier keer. Na de laatste wasbeurt voeg je zoutoplossing toe om het totale volume op 2,5 milliliter te brengen. Pipetteer 75 microliter zoutoplossing in elke put van een 0,3 milliliter 96-put plaat afhankelijk van het aantal putten dat nodig is voor de monsterset.

Vortex de 15-milliliter plastic standaard buis met LC-CSH drie keer gedurende 10 seconden per stuk. Met een enkele putpipet doe je 50 microliter LC-CSH langs de rechterzijde van de zoutwaterhoudende putten. Na drie putten herhaal je het vortexprotocol voordat je in de volgende drie putten wordt gedoseerd.

Draai de 96-put plaat 180 graden zodat de linkerkant van de putten nu naar rechts staat. Pipetteer 25 microliter plasma of serummonsters langs de rechterkant van elke put. Voor de positieve controleputten voeg 25 microliter referentie standaard menselijk normaal lipidemisch plasma of serum toe.

Vervolgens sluit je de 96-well-plaat stevig af met een lijmfolie en broed je de afgesloten plaat in het donker een uur bij 37 graden Celsius en 1.200 omwentelingen per minuut in een thermomixer. Na het incuberen haal je de plaat uit de thermomixer en leg je hem op ijs. Centrifugeer de plaat twee minuten op 935G bij 4 graden Celsius om de donordeeltjes te pelleten en de overdrachtsreactie te stoppen.

Verwijder nu voorzichtig de kleeffolie van de 96-well plaat zonder de LC-CSH pellet te verstoren. Breng 50 microliter supernatant van de reactieplaat over in de putten van een zwarte polystyreenplaat met een vlakke bodem van 96 putten met behulp van een multi-well pipet. Vul een reservoir met gewone zoutoplossing en voeg 50 microliter zoutoplossing toe aan elke put.

met een multi-well pipet. Bereid 1% Triton X-100 voor in een 125-milliliter plastic Erlenmeyer-fles. Vul een reservoir met de voorbereide 1% Triton X-100 en voeg 100 microliter van dezelfde oplossing bij kamertemperatuur toe aan elke put.

Meng door voorzichtig twee tot drie keer omhoog en omlaag te spuiten met een multi-well pipet en laat eventuele belletjes poppen met lucht uit een 3-milliliter transferpipet. Meet tenslotte lissamine rhodaminefluorescentie met een fluorometer met excitatie op 540 nanometer en emissie op 600 nanometer. Een standaardcurve werd gegenereerd met seriëel verdunde LRHPE, gelabeld als LC-CSH, en vertoonde een zeer lineaire fluorescentierespons.

In de plasmaconcentratiecurvestudie werden toenemende volumes gepoold menselijk plasma toegediend in driedubbele putten naast zoutoplossingscontroles. De plasmadosisresponscurve toonde uitstekende lineariteit tussen PE, afflux en plasmavolume met een sterke correlatie in het bereik van 15-35 microliter. Ons eenvoudige en snelle protocol, dat het risico op hart- en vaatziekten voorspelt, kan zowel voor onderzoek als voor klinische diagnostische studies worden gebruikt.

Onze bevindingen tonen aan dat onze test de rol van zowel cellulaire als extracellulaire plaquelipiden bij hart- en vaatziekten kan verduidelijken.