Evaluatie van de microbiële veiligheid van zuivelfabrieken met behulp van bacteriële proteomische profilering via de MALDI-benadering

We ontwikkelden een protocol om microbiële gemeenschappen te bereiden en te isoleren uit verschillende dagelijkse producten, zoals melk, room, boter en kaas. Eenmaal geïsoleerd kan dit micro-organisme snel en nauwkeurig worden geïdentificeerd met MALDI-TOF MS. Het optimaliseren van kweekomstandigheden blijft een belangrijke uitdaging, samen met databasegaten en de veeleisende extractie van grampositieve en sporenvormende bacteriën. Om te beginnen neem je een representatief monster van het zuivelproduct en meng je grondig om uniformiteit te waarborgen.

Aseptisch wordt één milliliter of één gram vaste monsters overgebracht in een 15-milliliter conische centrifugebuis met negen milliliter steriel vloeibaar medium. Draai de buis krachtig rond gedurende 30 tot 60 seconden om het monster te homogeniseren. Vervolgens bereid je een reeks tienvoudige verdunningen voor door één milliliter van de gehomogeniseerde suspensie over te brengen in opeenvolgende buizen, elk met negen milliliter steriele oplossing.

Meng elke verdunning grondig door te vortexen of te schudden. Neem vervolgens 0,1 milliliter van het oorspronkelijke monster, of een van de voorbereide verdunningen, en breng dit over op het oppervlak van een voorbereide Petrischaal met het juiste agarmedium. Met een steriele spreider verdeel je het inoculum gelijkmatig over het oppervlak van de agarplaat.

Voor aerobe incubatie inoculeer APT, M17, CBL, MPCA en TSA agarplaten met de voorbereide monsters. Incubeer de platen onder aerobe omstandigheden bij 37 graden Celsius en 30 graden Celsius gedurende 24 uur. Voor anaerobe incubatie plaats u de geïëntuculeerde MRS-agarplaten in een anaerobe kamer en incubeer ze bij 37 graden Celsius en 30 graden Celsius gedurende 24 tot 72 uur.

Verwijder de platen uit de broedmachine en controleer ze dagelijks om de microbiële groei te monitoren. Met een microbiële lus van één microliter streep je de geselecteerde kolonies op hetzelfde agarmedium om ze te subcultureren. Broed onder dezelfde omstandigheden als eerder.

Voor massaspectrometrieanalyse begin je met het voorbereiden van de MALDI-matrixoplossing. Bereid het oplosmiddelmengsel voor met 50% acetonitril, 47,5% HPLC-kwaliteit water en 2,5% trichloorazijnzuur. Los de matrixverbinding op in het oplosmiddelmengsel tot een uiteindelijke concentratie van ongeveer 10 milligram per milliliter.

Voor MS-identificatie van bacteriën met de directe kolonieoverdrachtsmethode, gebruik een steriele lus om één microliter van een gegroeide bacteriële kolonie op een plek op de MALDI-doelplaat over te brengen. Verspreid het bacteriële materiaal om een dunne, gelijkmatige laag op het bord te creëren. Na droogheid voeg je één microliter HCCA-matrixoplossing erop toe en laat je het aan de lucht drogen bij kamertemperatuur.

Voor de on-target mierenzuurextractiemethode gebruik je een wegwerpmicrobieel lusje of een steriele tandenstoker om een kleine hoeveelheid bacteriële biomassa uit één kolonie te halen. Smeer het materiaal direct op een plek op de MALDI-doelplaat om een dunne, gelijkmatige laag te creëren. Voeg één microliter 70% mierenzuuroplossing toe over het uitgesmeerde gebied.

Zodra de plek is opgedroogd, leg je er één microliter HCCA-matrixoplossing over en laat je het aan de lucht drogen bij kamertemperatuur. Voor de in-tube eiwitextractiemethode wordt één tot drie complete kolonies van een agarcultuurplaat overgebracht naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter met 300 microliter steriel water. Voeg 900 microliter absolute ethanol toe om een uiteindelijke ethanolconcentratie van ongeveer 75% te bereiken. Na het kort mengen van de inhoud, centrifugeer je de buis twee minuten op 15.000 g bij kamertemperatuur.

Gooi daarna voorzichtig het supernatant weg zonder de celpellet te verstoren. Voeg vervolgens 20 tot 50 microliter 70% mierenzuur toe aan de gedroogde celpellet. Meng de inhoud door te pipetteren of vortexen totdat de pellet volledig is hersteld.

Voeg nu een gelijke hoeveelheid acetonitril toe aan de mierenzuursuspensie en meng grondig. Centrifugeer de buis op 15.000 g gedurende twee minuten. Breng één microliter van het resulterende supernatant over op een aangewezen plek op een MALDI-doelplaat en laat het drogen.

Vervolgens leg je de opgedroogde plek over één microliter HCCA-matrixoplossing. Pipetteer één microliter van ofwel de bacteriële teststandaard met een extract van Escherichia coli DH5 alpha of de microbiologische kalibrator met E.coli ATCC 25922 eiwitextract, ribonuclease en myoglobine. Voor spectra-acquisitie en microbiële identificatie bereid kalibratiepunten voor op de MALDI-doelplaat.

Laad de MALDI-doelplaat met zowel de voorbereide monsterspots als de kalibervlekken in het massaspectrometrie-instrument. Voer de kalibratieanalyse uit in kalibratiemodus om het systeem te kalibreren. Bedien de massaspectrometer in lineaire positieve-ionenmodus voor algemene spectra-acquisitie.

Stel vervolgens het massadetectiebereik van de massaspectrometer in op een massa-ladingsverhouding van 2.000 tot 20.000. Verkrijg spectra in duplicaat voor elke plek om minstens vier technische replica's per sample te genereren. Pas nu de Savitzky-Golay-methode toe als een gladmakingsalgoritme.

Gebruik het TopHat-algoritme voor baselinecorrectie om achtergrondruis te verwijderen. Daarna detecteer je pieken met de centroidmodus. Upload de verwerkte massaspectra van onbekende bacteriële isolaten naar het microbiële identificatieplatform binnen de MALDI-software en voer de identificatie uit.

Evalueer de identificatiescores volgens de drempelnormen van de fabrikant. De massaspectrometriespectra toonden soortspecifieke eiwitprofielen, waardoor identificatie op geslachts- of soortniveau mogelijk was. De dendrogram toonde een hoge gelijkenis tussen stammen van dezelfde soort en duidelijke differentiatie tussen soorten.

Een kortere incubatietijd van 12 uur voor Bacillus licheniformis leverde een hogere ID-score van 2,38 op, terwijl een langere incubatie van 18 tot 24 uur leidde tot een lagere ID-score van 1,85 vanwege de dominantie van sporensignalen. Onder de monstervoorbereidingsmethoden gaf de eiwitextractie in de buis de hoogste ID-score van 2,23, gevolgd door on-target mierenzuurextractie met 1,97 en directe kolonieoverdracht, wat resulteerde in de laagste score van 1,61. Door culturomics te combineren met op maat gemaakte monstervoorbereiding, maakt MALDI nauwkeurigere en snellere microbioomanalyse mogelijk tegen lagere kosten, wat resulteert in resultaten vergelijkbaar met de referentie 16S rRNA-methoden.

Dit protocol maakt routinematige, doorvoerkrachtige monitoring van micro-organismen in zuivelproducten mogelijk, verbetert de detectiesnelheid en nauwkeurigheid en versterkt uiteindelijk de voedselkwaliteit en veiligheidssystemen. Het uitbreiden van MALDI-databases en het automatiseren van workflows in industriële laboratoria zal de identificatie van microbiële micro's verbeteren, de doorvoersnelheid verhogen, fouten verminderen en de monitoring van microbiota versnellen.