Monstervoorbereiding voor eencellige massaspectrometrie Metabolomics-onderzoeken: gecombineerd cellenwassen, afschrikken, drogen en bewaren

We hebben protocollen ontwikkeld om de integriteit van cellulaire metabolieten te behouden voor eencellige massaspectrometriestudies. We onderzochten hoe was-, blus- en bewaarcondities de celmetabolieten beïnvloeden. Onlangs zijn nieuwe methoden voor monstervoorbereiding en massaspectrometrietechnieken ontwikkeld om single-cell metabolomics-studies te bevorderen om cellulaire heterogeniteit en ziektemechanismen beter te begrijpen.

Onderzoekers moeten meerdere belangrijke uitdagingen overwinnen, waaronder een beperkte hoeveelheid monsters, verminderde detectiegevoeligheid als gevolg van de complexiteit van het monster en gewijzigde metabolieten als gevolg van monstervoorbereiding en -analyse. We demonstreren uitgebreide monstervoorbereidingstechnieken die cellulaire metabolieten en celintegriteit kunnen behouden voor metabolomische studies met eencellige massaspectrometrie. Onze protocollen kunnen een eenvoudige en effectieve manier bieden voor de voorbereiding, opslag en transport van monsters voor metabolomische studies met één cel met behulp van verschillende massaspectrometrische technieken.

Incubeer om te beginnen de cellen bij 37 graden Celsius in een bevochtigde incubator die 5% koolstofdioxide bevat. Bewaak dagelijks de samenvloeiing van de cellen en passeer ze wanneer culturen 80% samenvloeiing bereiken. Zuig voor het passeren het medium uit de schaal en spoel één keer af met vijf milliliter PBS.

Incubeer de cellen met twee milliliter 0,25% trypsine EDTA bij 37 graden Celsius gedurende drie minuten om de celloslating te vergemakkelijken. Neutraliseer de trypsine door acht milliliter voorverwarmd volledig medium toe te voegen en voorzichtig te pipetten om de cellen te verspreiden. Breng een milliliter van de suspensie over in negen milliliter vers, compleet medium voor het tellen van de cellen.

Om de cellen te zaaien, verdunt u ze tot een uiteindelijke concentratie van één keer 10 tot de macht van zes cellen per milliliter. Plaats individuele glazen afdekkingen van 18 millimeter in de putjes van een plaat met 12 putjes. Voeg twee milliliter compleet medium en 200 microliter celsuspensie toe aan elk putje om twee keer 10 tot de macht van vijf cellen per putje te krijgen.

Incubeer de cellen een nacht om hechting mogelijk te maken. Voeg voor het wassen van de cellen twee milliliter koude ammoniumformiaatoplossing toe aan elk putje van de plaat met 12 putjes. Til vervolgens met een steriele tang voorzichtig elk dekglaasje met aanhechtingscellen uit het putje en plaats het kort gedurende twee tot drie seconden in een apart putje dat vooraf is gevuld met twee milliliter koude 0,9% ammoniumformiaatoplossing.

Plaats elk met ammoniumformiaat gespoeld dekglaasje met de cellen naar boven in een petrischaaltje in een bakje van aluminiumfolie. Giet langzaam 10 tot 20 milliliter vloeibare stikstof over de dekglaasjes om een volledige dekking te garanderen. En kantel de petrischaal onmiddellijk met een pincet om de resterende vloeibare stikstof te decanteren.

Gebruik cryogene handschoenen en een geïsoleerd pincet om de petrischaal met de koelkap van vloeibare stikstof in de vacuümconcentratorkamer te plaatsen. Verwerk de monsters met behulp van de standaard vacuüminstellingen gedurende vijf tot zeven minuten totdat de zichtbare vloeibare stikstof is verdampt en de dekglaasjes droog lijken. Zorg ervoor dat de gedroogde dekglaasjes geen vloeibare stikstof of ijskristallen bevatten.

Wikkel de container vervolgens in met een papieren handdoek en breng deze 48 uur over naar een vriezer van 80 graden Celsius. Breng na opslag de dekglaasjes met de petrischaal gedurende 10 minuten over in een droogmiddel op kamertemperatuur. Zorg ervoor dat gecondenseerde rijp of water op de afdekglaasjes volledig is verdwenen voordat u ze uit de exsiccator verwijdert.

Verdeel de monsters in twee groepen en behandel ze op de juiste manier. Monteer nu de enkele sonde op de XYZ-tafel en bevestig deze op een gemotoriseerde XYZ-manipulator die onder een digitale microscoop is geplaatst. Koppel de opstelling met één sonde aan een massaspectrometer voor SCMS-analyse.

Gebruik acetonnitril dat 0,1% mierenzuur bevat met een zuiverheid van ten minste 99,9% als extractieoplosmiddel en lever het af met een debiet van 150 nanoliter per minuut met behulp van een spuitpomp. Stel de massaspectrometrieparameters in voor positieve en negatieve ionenmodi. Plaats nu de twee dekglaasjes van groep één en groep twee samen op de gemotoriseerde XYZ-trap van de SCMS-opstelling met enkele sonde en gebruik de microscoop om willekeurig cellen te selecteren voor analyse.

Na het verkrijgen van massaspectra, analyseert u ongeveer 30 cellen per groep met behulp van dezelfde enkele sonde, oplosmiddeldebiet en ionisatiespanning. De onbewerkte SCMS-gegevens zijn voorbewerkt met behulp van een aangepast R-script en passen achtergrond- en ruisverwijdering toe, gevolgd door normalisatie van de ionenintensiteit naar de totale ionenstroom. De-isotoop de SCMS-gegevens met behulp van de MSD-isotoop van het Python-pakket.

Piekuitlijning uitvoeren met behulp van een intern Python-script. Pas een bakbreedte van 0,01 hoofdladingsverhouding toe voor binning en een massatolerantie van 0,01 hoofdladingsverhouding of vijf delen per miljoen voor piekuitlijning. Statistische gegevensanalyse uitvoeren met behulp van Metabo Analyst 6.0.

Voer een T-test uit en genereer een heatmap met relatieve metabolietniveaus. Selecteer de optie die wordt gebruikt top 100 en T-test of Inova om de top 100 metabolieten te genereren, gerangschikt op significantie, en plot een heatmap met behulp van deze top 100 metabolieten met significante verschillen. Zoek ten slotte de nauwkeurige masterladingswaarden tegen de database met menselijk metaboloom met behulp van een massatolerantie van 10 delen per miljoen voor het doorzoeken in de database.

Analyse van de hoofdcomponenten in de positieve ionenmodus toonde aan dat groep één en groep twee elkaar nauw overlapten, wat wijst op zeer vergelijkbare metabolietprofielen. In de negatieve ionenmodus werd een vergelijkbaar patroon waargenomen, hoewel groep twee iets duidelijker leek. Heatmap-analyse van de top 100 metabolieten toonde zeer consistente abundantiepatronen tussen groep één en groep twee in beide ionenmodi.

Er worden geen grote verschuivingen of groepsspecifieke clustering waargenomen. Hoewel kleine variaties in enkele metabolietclusters verschillen in ionisatie-efficiëntie of metabolietstabiliteit kunnen weerspiegelen.