Precisie-inductie en onderscheid van hoest- en niesreflexen bij muizen

Dit protocol richt zich op de ademhalingsreflex bij muizen. We streven ernaar de luchtpijp en de neusholte te stimuleren om hoesten en niezen op te wekken, en we zullen deze twee soorten gebeurtenissen onderscheiden op basis van de audiofuncties. Eerdere studies gebruikten vaak vernevelde capsaïcine of citroenzuur om de ademhalingscontrole en hoest- en niesgedrag bij muizen te stimuleren.

Het blijft echter onduidelijk of ademhalingscontrole-stimulatie door nebulisatie hoesten, niezen of beide veroorzaakt, aangezien er momenteel geen betrouwbare methode is om deze twee reacties van elkaar te onderscheiden. Voor dit project hebben we een methode ontwikkeld om hoesten en niezen op te wekken door selectief de luchtpijp of neusholte te stimuleren. We gebruikten ook akoestische analyse om de onderscheidende kenmerken tussen hoesten en niezen te identificeren.

Ons massale onderzoek biedt een krachtig hulpmiddel dat direct de ontwikkeling van toekomstige medicijnen voor hoest- en niesstoornissen zal ondersteunen. Om te beginnen snijd je een naald van 28 gauge in een canule van ongeveer vijf millimeter lang. Gebruik een tang en schuurpapier, maak beide uiteinden glad en bevestig één uiteinde aan siliconen buis.

Verbind de buisbevestigde canule met een spuit van één milliliter en spoel de canule door met water om de openheid te controleren. Buig vervolgens de canule onder een hoek van 90 graden met een verhouding van twee op drie armen. Steek de langere arm in de vijf centimeter lange siliconen buis.

Verdeel muizen willekeurig in drie groepen, elk met zes muizen. Zet nu de verdoofde muis op rug op de tafel. Na het scheren van het schedel- en baarmoederhalshaar, desinfecteer je het gebied met jodofore en alcohol.

Snijd onder een microscoop de baarmoederhuid ongeveer één centimeter in en snijd bot door weefsels en spieren om de luchtpijp bloot te leggen. Doorboor het zachte weefsel tussen het cricoïdale en het tracheale kraakbeen met een naald van 32 gauge. Maak vervolgens een minimale tracheale opening met een oogschaar.

Steek de met siliconen beklede metalen canule ongeveer één millimeter in het tracheale lumen en sluit de canule-trachea verbinding vast met een 7-0 hechting. Snijd nu ongeveer één centimeter in de hoofdhuid en tunnel stomp subcutaan van de nek naar de schedel. Leid de siliconen buis door de onderhuidse tunnel naar de schedel, bevestig deze op de schedel met tandcement, en hecht vervolgens de huid.

Naai de cervicale incisie en laat het dier vijf dagen herstellen. Plaats de ultrasone probe met een poort-compatibele afdichtring en steek de probe in de poort van de plethysmografiekamer van het hele lichaam om luchtdicht contact te garanderen. Verbind de plethysmografiekamer voor het hele lichaam met de stroomsensor en het biasstroomsysteem.

Bevestig een met de schedel vastgezette siliconenbuis op een verlengbuis van 30 centimeter en plaats de muis in de plenthysmografiekamer voor het hele lichaam. Verleng de buis door de bovenste poort van de kamer en sluit de poort af met boetseerklei rond de buis. Controleer de luchtdichtheid door te controleren of de ademhalingsgolfpieken binnen vier, plus of min twee liggen.

Verbind een injectiespuit van één milliliter met vijf milliliter capsaïcineoplossing op de verlengbuis en monteer deze op de microinjectiepomp. Plaats een hogesnelheidscamera gericht op de kamer. Pas de cameraafstand en focus aan voor een helder beeld, en stel de samplefrequentie in op 160 frames per seconde.

Begin nu tegelijkertijd met de plethysmografie van het hele lichaam, de echo en de camerasoftware. Start de pomp om met capsaïcine te beginnen en registreer de hoestwaarden gedurende 10 minuten. Bereid de dieren en alle benodigde materialen voor de procedure voor.

Na het verdoofen en voorbereiden van de muis, zet je hem vast in een stereotaxisch frame. Desinfecteer het operatiegebied met jodofore en alcohol. Inceer de huid over de schedel en het neusbot, waarbij je met een scalpel het neusbot blootlegt.

Met een microboor maak je een 0,5 millimeter groot gat bij de overgang tussen het neusbot en het laterale uitsteeksel van het neusseptumkraakbeen. Nu, maak het neusslijmvlies bloot via het maalgat. Tilt voorzichtig het neusslijmvlies op met een naald van 32 gauge om de neusholte bloot te leggen.

Vervolgens monteer je de polyethyleenbuis in de stereotacische arm. Lijn de punt van de buis gelijk uit met de opening van het braamgat, bevestig de buis met tandcement op het neusbeen en hecht vervolgens de huid. Leg de muis op een verwarmingskussen en laat hem herstellen tot het bewustzijn terugkeert.

Verbind de plethysmografiekamer van het hele lichaam met de flowsensor en het biasflowsysteem volgens de handleiding van de fabrikant. Vervolgens vervang je de ultrasone met een poort-aangepaste pakking. Plaats de probe in de plethysmografiekamer en controleer een luchtdichte afdichting.

Breng de muis over in de plethysmografiekamer en verleng de polyethyleenbuis door de bovenste poort. Sluit de poort af met boetseringsklei om de buis vast te zetten. Controleer de luchtdichtheid van de kamer en stel de camera op zoals eerder getoond.

Tot slot brengt u een nylonfilament van 0,25 millimeter diameter door een zachte buis naar de neusholte tot een diepte van nul tot drie millimeter. Houd vijf centimeter van het filament bloot voorbij de handbuis. Druk tijdens elke stimulatie op het vrije uiteinde van het filament totdat het ongeveer 45 graden buigt, waarbij ongeveer 0,6 gram kracht op het neusslijmvlies wordt uitgeoefend gedurende één seconde.

Herhaal de stimulatie eens in de 30 seconden terwijl je niesreacties gedurende 10 minuten registreert. Muizen die werden onderworpen aan tracheale of neuschirurgie met mechanische neusstimulatie en capsaïcine tracheale uitdaging verhoogden respectievelijk de nies- en hoestgebeurtenissen significant. Plethysmografie-opnamen van het hele lichaam toonden zowel enkelvoudige als dubbele piek ademhalingssporen voor capsaïcine-geïnduceerd hoesten en mechanisch geïnduceerd niezen.

Geluidsoscillodgrammen toonden aan dat hoestaudio aan het begin een abrupt beginnende piekintensiteit had en geconcentreerd was in het bereik van nul tot 30 kilohertz. Terwijl niesgeluid geleidelijk in intensiteit toenam, een bereik van nul tot 80 kilohertz besloeg en een langere duur had. De compressiefase van enkelpiekhoest was gemiddeld ongeveer 32,39 milliseconden, aanzienlijk korter dan dubbele piekhoest, rond de 53,17 milliseconden.

De gemiddelde compressiefase van enkelpiekniezen was ongeveer 44,03 milliseconden, terwijl dubbele piekniezen gemiddeld rond de 74,24 milliseconden lagen en aanzienlijk langer waren. Enkele piekpatronen kwamen voor bij 77,55% van de hoestbuien, terwijl slechts 32,42% van de niezen enkele pieken vertoonde, met dubbele piekpatronen die domineerden bij 67,58%. Niesgeluidsduur was significant langer dan hoestduur, hoewel met overlappende bereiken. De doorsnijding van de nasale sensorische afferenten verminderde capsaïcine-geïnduceerde niezen significant, terwijl hoesten onaangetast bleef.