Name: Actine Co-Sedimentatie Assay, want de analyse van eiwit binding aan F-actine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-28T01:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Leer de actine co-sedimentatie assay om eiwitbinding aan F-actine te analyseren. Deze in vitro methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van actine-bindende eiwitten en hun rol in celbiologische processen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dank aan dr. Praveen Kumar in de Wittman lab aan de UCSF voor de film van actine in HaCAT cellen.

1. De voorbereiding van actine De bron van actine die in deze test was niet-spier menselijke bloedplaatjes (β-actine) verkregen van cytoskelet Inc Stock fracties bij 10 mg / ml worden bewaard in de -70 º C vriezer. Voor de test, is het actine verdund tot 0,4 mg / ml in een buffer die 5 mM Tris pH 8, 0,2 mM CaCl2, 0,2 mM ATP en 0,5 mM DTT, gecentrifugeerd bij 20.000 g gedurende 10 minuten bij 4 º C. De bovenstaande vloeistof, die wordt monomere actine is klaar om te worden gepolymeriseerd. Actine polymerisatie wordt veroorzaakt door de toevoeging 50 mM KCl, 1 mM ATP en 2 mM MgCl 2. De polymerisatie gebeurt bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. 2. Toebereiding van proteïne In deze test gebruiken we de C-terminus van Tallinn, die is gezuiverd als een GST-gelabeld eiwit. Het eiwit te gebruiken in de test wordt onderworpen aan een hoge snelheid centrifugeren om pre-clear van aggregaten voorafgaand aan de incubatie met F-actine. Het eiwit wordt gesponnen bij 100.000 g in een Beekman ultracentrifuge voor 20 minuten bij 22 º C. 3. Actine-eiwit Incubatie De hoeveelheid actine en eiwit in een assay zal variëren. In dit voorbeeld gebruiken we actine in overmaat. Normaal gesproken wordt een molaire verhouding berekend, bijvoorbeeld. een 4:1 molaire verhouding van actine aan eiwit. In de volgende test, het uiteindelijke reactie volume is 150 pl. De buffer, waarin het eiwit en F-actine worden geïncubeerd zal afhangen van het eiwit te testen en over het vereiste voorwaarden. In dit voorbeeld gebruiken we een buffer die 10 mM Tris pH 7,0, 1 mM ATP, 0,2 mM DTT, 1 mM EGTA, 0,1 mM CaCl 2 en 2 mM MgCl 2. Het eiwit-en F-actine worden geïncubeerd in de buffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. 4. Sedimentatie van F-actine Na de incubatie, zijn de monsters gecentrifugeerd bij 100.000 g bij 22 º C. We maken gebruik van een Beekman ultracentrifuge in de video. De rotor is voorzichtig verwijderd, omdat niet aan de pellets verstoren. 5. Analyse van proteïne co-afzetting met F-actine De supernatanten worden zorgvuldig verwijderd door pipetteren in een eppendorfbuisje en 5 X Laemmli SDS-PAGE sample buffer wordt toegevoegd. Een geschikt volume van een X Laemmli SDS-PAGE sample buffer wordt toegevoegd aan de pellets resterende gepipetteerd op en neer, en overgebracht naar nieuwe eppendorf buizen. De relatieve hoeveelheden van eiwit in de pellets en de supernatanten worden geanalyseerd na hun scheiding door SDS-PAGE en Coomassie Blue kleuring van de gel of Western blotting. Met het oog op de specificiteit van eiwit interacties te bepalen met actine, de concentratie actine-afhankelijke co-afzettingen kunnen worden uitgevoerd. Voor dit soort van experiment, een vast bedrag van het eiwit en een reeks van toenemende hoeveelheden van actine worden geïncubeerd, en de analyse wordt uitgevoerd zoals hierboven beschreven.

<ol><li>Senetar, M. A., Foster, S. J., McCann, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrasteric+inhibition+mediates+the+interaction+of+the+I%2FLWEQ+module+proteins+Talin1%2C+Talin2%2C+Hip1%2C+and+Hip12+with+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Intrasteric inhibition mediates the interaction of the I/LWEQ module proteins Talin1, Talin2, Hip1, and Hip12 with actin.</a> Biochemistry. 14, 15418-15428 (2004).</li>
<li>Goldmann, W. H., Hess, D., Isenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+intact+talin+and+talin+tail+fragment+on+actin+filament+dynamics+and+structure+depends+on+pH+and+ionic+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The effect of intact talin and talin tail fragment on actin filament dynamics and structure depends on pH and ionic strength.</a> Eur J Biochem. 260, 439-445 (1999).</li>
<li>Lee, H., Bellin, R. M., Walker, D. L., Patel, B., Powers, P., Liu, H., Garcia-Alvarez, B., de Pereda, J., Liddington, R. C., Volkmann, N., Hanein, D., Critchley, D. R., Robson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+Actin-binding+Site+within+the+Talin+FERM+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of an Actin-binding Site within the Talin FERM Domain.</a> J Mol Biol. 22, 771-784 (2004).</li>
</ol>

Actine co-sedimentatie is een eenvoudig in vitro test op specfic eiwitten binden aan F-actine te analyseren. In deze video, tonen we een voorbeeld van hoe een eenvoudige actine co-sedimentatie kan worden uitgevoerd. Laten we zien hoe F-actine te bereiden, voor te bereiden het eiwit te testen en de procedure van actine co-sedimentatie. Een aantal punten moet worden overwogen wanneer het uitvoeren van actine co-sedimentatie assays. Zo kan de buffer componenten voor de incubatie variëren, afhankelijk van het eiwit te worden getest en pH, tempe...

actine co-sedimentatie assay, want de analyse van eiwit binding aan f-actine

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Het actine cytoskelet in de cel is een netwerk van actine filamenten die de beweging van cellen en cellulaire processen toelaat, en dat genereert spanning en helpt behoudt cellulaire vorm. Hoewel het actine cytoskelet is een rigide structuur, het is een dynamische structuur die constant is remodeling. Een aantal van de eiwitten kunnen binden aan het actine cytoskelet. De binding van een bepaald eiwit tot F-actine is vaak gewenst is om celbiologische waarnemingen te ondersteunen of om verder te begrijpen dynamische processen als gevolg van verbouwing van het actine cytoskelet. De actine co-sedimentatie assay is een in vitro test routinematig gebruikt om de binding van specifieke eiwitten of eiwit-domeinen met een F-actine te analyseren. De uitgangspunten van de test gepaard gaan met een incubatie van het eiwit van belang (volledige lengte of het domein van) met F-actine, ultracentrifugatie stap naar pellet F-actine en analyse van het eiwit co-sedimenting met F-actine. Actine co-sedimentatie testen kunnen daarom worden ontworpen om actine bindingsaffiniteiten en in concurrentie testen te meten.

Eiwitten binden aan filamenteuze actine (F-actine) door middel van verschillende actine-bindend modules. In deze video laten we zien de procedure van de actine co-sedimentatie, die een in vitro test routinematig gebruikt om eiwitten of specifieke domeinen die binden F-actine te analyseren.

Actine Co-Sedimentatie Assay, want de analyse van eiwit binding aan F-actine

Het actinecytoskelet in de cel is een netwerk van actinefilamenten dat celbeweging en cellulaire processen mogelijk maakt en dat ... genereert

In de cel. Het actinecytoskelet is een dynamische structuur en de remodellering ervan is belangrijk bij uiteenlopende processen, van celdeling en celmigratie tot fysiek transport. Een grote verscheidenheid aan eiwitten kan binden aan het actinecytoskelet via verschillende actinebindende modules.In deze video demonstreren we de procedure voor actine-cosedimentatie, een in vitro assay die routinematig wordt gebruikt om eiwitten of specifieke domeinen van eiwitten te analyseren die binden aan filamenteus actine. Hallo, ik ben Jody Var van het laboratorium van Dr. Diane Barber bij de afdeling Cel- en Weefselbiologie aan de UCSF. In deze video laat ik u de procedure zien voor het uitvoeren van een actine-cosedimentatie-assay.Deze procedure is een methode om eiwitten te analyseren die specifiek binden aan filamenteuze actine en kan worden gebruikt om bindingsaffiniteiten te meten. Deze procedure omvat de volgende stappen: het vormen van actinefilamenten en de preparatie van het te testen eiwit. Het incuberen van het eiwit van interesse met filamenteuze actine, of kortweg f actine; het pelleten van F actine door ultracentrifugatie bij 100.000 ×g; en SDS-PAGE en Coumassestaining om de supernatant- en pelletfracties te visualiseren.En tot slot de analyse van het eiwit dat co-sedimenteert met f-actine in de pelletfractie. Laten we beginnen. Om actinefilamenten te prepareren, is het raadzaam om er zeker van te zijn dat het actine waarmee we werken in monomere vorm is.Een voorraadoplossing van actine van 10 mg/ml wordt uit de vriezer van -80 °C gehaald en er wordt een werkverdunning van 2,4 mg/ml gemaakt in een buffer die tris, calciumchloride, ATP voor monomerstabilisatie en DTT bevat. De werkverdunning wordt gedurende één uur op ijs geplaatst. Na één uur incubatie op ijs wordt de actine-oplossing gecentrifugeerd bij 14.000 RPM gedurende 10 minuten bij 4 °C.Het resulterende supernatant is het monomere actine. Vanuit deze gezuiverde actine-monomeren kan nu filamenteus actine worden gegenereerd door toevoeging van kaliumchloride, magnesiumchloride en een TP gedurende één uur. Bij kamertemperatuur is het filamenteuze actine nu klaar om te incuberen met het eiwit of het eiwitdomein van belang, wat we in de volgende stap zullen laten zien.Om verder te gaan met de actine-cosedimentatie-assay, moeten we het eiwit voorbereiden dat getest zal worden. Vandaag gebruik ik het clan, dat is gezuiverd als een GSC-fusie-eiwit. Het eiwit is door middel van ultracentrifugatie vooraf gereinigd van aggregaten en de resulterende supernatant is nu klaar voor gebruik in de assay.Om de eiwitbinding aan actine te testen, moet actine in overmaat aanwezig zijn. In dit geval worden 10 microgram actine geïncubeerd met vijf microgram eiwit in een buffer die tris, ATP, BTME, capto-ethanol, EGTA en calciumchloride bevat, om een totaalvolume van 150 microliters voor de eiwit-actine-incubatie te verkrijgen. De incubaties worden gedurende één uur bij kamertemperatuur direct in ultracentrifugebuizen uitgevoerd. Buizen één en twee dienen als controlebuizen. Buis één bevat enkel actine in buffer.Buis twee bevat alleen eiwit in de buffer. Buis drie bevat zowel actine als de CNU van tailin in buffer twee. Buis vier is een aanvullende controle voor aspecifieke binding en bevat alleen actine en GST-eiwit. Na de incubatie van één uur worden onze monsters zorgvuldig in de Beckman-rotor geplaatst.Vervolgens stellen we de ultracentrifuge in op 100.000 ×g en centrifugeren we de monsters gedurende 20 minuten bij 22 °C. Na deze centrifugeerstap konden we onze monsters voorbereiden voor analyse via SDS-PAGE. Na de centrifugeerbeurt van 20 minuten worden de monsters voorzichtig uit de rotor verwijderd, zodat de pellet niet wordt verstoord. Op de zijkant van de buis wordt een markering aangebracht op de plek waar de pellet zich bevindt.Zorgvuldig wordt de supernatant overgebracht naar Eppendorf-buisjes waaraan vijf µL XSCS-monsterbuffer is toegevoegd. Eén µL XSCS-monsterbuffer wordt toegevoegd aan het pellet dat in de ultracentrifugebuisjes is gebleven. Na herhaaldelijk pipetteren wordt het resuspendeerde pellet overgebracht naar een nieuw Eppendorf-buisje.De monsters worden vervolgens tot 10 minuten gekookt in een warmteblok. Na het koken worden de monsters op een SDS-PAGE-gel geladen. Hier gebruik ik een reeds bereide 10%gel.De monsters worden zorgvuldig in de juiste volgorde in de putjes geladen. De gel wordt gedurende ongeveer één uur bij kamertemperatuur op een constant voltage gerund. Nadat de gelrun is voltooid, kleuren we deze met Kumasi blauw om de eiwitten te visualiseren.Kumasi blauw-oplossingen moeten de gel volledig bedekken. De gel wordt gedurende ten minste 20 minuten in een schudapparaat geplaatst. Vervolgens wordt de ESI blauw-oplossing verwijderd en wordt de gel ondergedompeld in een ontkleuringsoplossing.De gel wordt ongeveer een uur op een schudmachine gelaten totdat er banden in de gel zichtbaar zijn. Na Coomassie-kleuring kan de gel worden geanalyseerd om de relatieve hoeveelheid eiwit in de supernatant- versus de pelletfracties te bepalen. Als we kijken naar de gel die is gelabeld in baan één en twee, kunnen we de supernatant- en pelletfracties van enkel actine zien.In banen drie en vier bevonden zich de supernatant- en pelletfracties van alleen de C-terminale staart. In banen vijf en zes bevonden zich de supernatant- en pelletfracties van de incubatie van actine en de C-terminale staart. In banen zeven en acht bevonden zich de supernatant- en pelletfracties van de incubatie van actine en het GST-eiwit.Zoals u kunt zien, is de CT van de staart alleen zichtbaar in de palletfractie in baan zes. De resultaten van deze gel duiden op een specifieke binding van de C-terminus, de staart, aan actine. In deze video heeft u gezien hoe u een actine-cosedimentatie-assay uitvoert.Actine-cosedimentatieassays zijn een in vitro methode om actinebindende eiwitten te analyseren. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om op de volgende punten te letten. Pre-clear uw eiwit van belang om een negatieve controle van het eiwit alleen op te nemen voor elke incubatie van actine met het eiwit.Deze controle zal aantonen of een van de voorgeklaarde eiwitten op zichzelf neerslaat, aangezien de binding aan f door sommige eiwitten gevoelig kan zijn voor de pH, temperatuur of zoutconcentratie in de buffer. Dat is alles. Bedankt voor het kijken en veel succes met uw experimenten.

actin-co-sedimentation-assay-for-analysis-protein-binding-to-f

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

We passen label-free eiwit interactie analyse met behulp van Biacore X100 voor structuur-functie analyse van de binding van verschillende cystatine B mutanten te papaïne door kinetische karakterisering. Kalibratie-vrije concentratie analyse (CBVC) meet de concentratie van het eiwit met behoud van bindende activiteit, zonder de noodzaak van een standaard curve. We tonen aan dat de bevestiging van de concentraties met behulp van CFCA verhoogt de betrouwbaarheid van de kinetische analyse en dat...

Het belang van correcte eiwitconcentratie voor Kinetics en affiniteit Bepaling in structuur-functie analyse

This video describes the technique of studying the cytoskeleton and focal adhesions in primary human colon cancer cells to understand its variations depending on substrate rigidity. This culture of cancer cells on soft and hard substrates allows various downstream biophysical measurements for cancer prognosis.

Cytoskeleton and Focal Adhesion Organization Assay: An Immunofluorescence-based Method to Study Cell Adhesion and Spreading on Substrates

Polymerisatie van FtsZ is essentieel voor bacteriële celdeling. In dit rapport beschrijven we eenvoudige protocollen om de polymerisatieactiviteit van FtsZ te monitoren en bespreken we de invloed van de buffersamenstelling. De protocollen kunnen worden gebruikt om de interactie van FtsZ met regulerende eiwitten of antibacteriële geneesmiddelen die de polymerisatie van FtsZ beïnvloeden, te bestuderen.

FtsZ polymerisatie Testen: Eenvoudige Protocollen en overwegingen

Dit protocol beschrijft een methode om het vermogen van een eiwit om te co-sedimenteren met filamenteuze actine (F-actine) te testen en, als de binding wordt waargenomen, de affiniteit van de interactie te meten.

Meting van eiwitbinding aan F-actine door co-sedimentatie

Vroege endosome functies is afhankelijk van F-actine polymerisatie. Hier beschrijven we een microscopie gebaseerde in vitro -assay die reconstitutes de nucleatie en polymerisatie van de F-actine op vroege endosomal membranen in proefbuizen, waardoor deze complexe reeks reacties vatbaar voor biochemische en genetische manipulaties.

In Vitro Polymerisatie van F-actine op vroege Endosomen

We rapporteren een eenvoudige, tijdsefficiënte en op fluorescentiespectroscopie gebaseerde test met hoge doorvoer voor de kwantificering van actinefilamenten in ex vivo biologische monsters van hersenweefsels van knaagdieren en menselijke proefpersonen.

Een tijdsefficiënte fluorescentiespectroscopie-gebaseerde test voor het evalueren van de Actin-polymerisatiestatus in knaagdier- en menselijke hersenweefsels

Om vooruit te komen, moeten groeikegels tractiekrachten uitoefenen tegen de externe omgeving. Het genereren van trekkrachten is afhankelijk van actinedynamiek en koppeling. De huidige studie beschrijft methoden voor het analyseren van actinedynamica, koppelingskoppeling en tractiekrachten voor groeikegelvoortgang.

Analyses van actinedynamica, koppelingskoppeling en tractiekracht voor groeiconusvooruitgang

Dit protocol beschrijft de vorming van ondersteunde lipide bilayers en de toevoeging van cytoskeletale filamenten en motoreiwitten om de dynamiek van gereconstitueerde, membraangebonden cytoskeletale netwerken te bestuderen met behulp van fluorescentiemicroscopie.

Reconstitutie van membraangebonden minimale actinecorticosterces op ondersteunde lipidebilagen

Dit protocol beschrijft hoe actinekometen op de oppervlakken van kralen kunnen worden geproduceerd met behulp van in de handel verkrijgbare eiwitingrediënten. Dergelijke systemen bootsen de uitstekende structuren in cellen na en kunnen worden gebruikt om fysiologische mechanismen van krachtproductie op een vereenvoudigde manier te onderzoeken.

Reconstitutie van op actine gebaseerde motiliteit met commercieel verkrijgbare eiwitten

Deze methode beschrijft een op lectine gebaseerde in vitro sedimentatietest om de bindingsaffiniteit van glucaanfosfatase en amylopectine te kwantificeren. Deze co-sedimentatietest is betrouwbaar voor het meten van glucaanfosfatasesubstraatbinding en kan worden toegepast op verschillende opgeloste glucaansubstraten.

Concanavaline A-gebaseerde sedimentatietest om substraatbinding van glucaanfosfatasen te meten

Hier presenteren we methoden voor het bereiden van quasi-tweedimensionale (2D) verstrengelde, verknoopte en vloeibare kristalactine-assemblages van gezuiverde eiwitten.

Het afstemmen van de contractiliteit en vervormingsmodi van actieve op actine gebaseerde assemblages in vitro: van tweedimensionale actieve netwerken tot druppels van vloeibare kristallen

Leer de actine co-sedimentatie assay om eiwitbinding aan F-actine te analyseren. Deze in vitro methode helpt onderzoekers bij het bestuderen van actine-bindende eiwitten en hun rol in celbiologische processen.

Actine Co-Sedimentatie Assay, want de analyse van eiwit binding aan F-actine

Meer video's verkennen